इमेजिंग बेमेल मरम्मत और डीएनए में नुकसान के लिए सेलुलर प्रतिक्रियाएँ बेसिलस subtilis</em

Summary

एक विस्तृत प्रोटोकॉल इमेजिंग के लिए डीएनए की मरम्मत परिसरों के वास्तविक समय में गठन में वर्णित है<em> बेसिलस subtilis</em> कोशिकाओं.

Abstract

दोनों prokaryotes और eukaryotes शारीरिक परिवर्तनों का एक जटिल सेट के माध्यम से डीएनए की क्षति का जवाब. जीन अभिव्यक्ति, मौजूदा प्रोटीन के पुनर्वितरण, और नए प्रोटीन परिसरों की विधानसभा में बदलाव डीएनए घावों और बेमेल डीएनए आधार जोड़े की एक किस्म के द्वारा प्रेरित किया जा सकता है. प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी visualizing और बढ़ाता डीएनए घावों और जटिल subcellular वास्तुकला के भीतर एक जीवित कोशिका के डीएनए प्रतिकृति स्थिति की निगरानी के लिए इन और अन्य प्रतिक्रियाओं के लिए एक शक्तिशाली प्रायोगिक उपकरण के रूप में इस्तेमाल किया गया है. यह फ्लोरोसेंट संवाददाता प्रोटीन और डीएनए प्रतिकृति और मशीनरी की मरम्मत के घटकों के बीच translational fusions cues निर्धारित करने के लिए इस्तेमाल किया गया है कि लक्ष्य डीएनए उनके आत्मीय घावों की मरम्मत प्रोटीन<em> Vivo में</em> और समझने के लिए कैसे इन प्रोटीनों बैक्टीरियल कोशिकाओं के भीतर का आयोजन कर रहे हैं. इसके अलावा, transcriptional और translational डीएनए क्षति inducible प्रमोटरों से जुड़े fusions से पता चला है जो आबादी के भीतर कोशिकाओं genotoxic तनाव प्रतिक्रियाओं सक्रिय है. इस समीक्षा में, हम प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी का उपयोग एकल बैक्टीरियल कोशिकाओं में डीएनए की मरम्मत और डीएनए प्रतिकृति परिसरों के विधानसभा छवि के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं. विशेष रूप में, इस काम बेमेल मरम्मत प्रोटीन इमेजिंग, मुताबिक़ पुनर्संयोजन, डीएनए प्रतिकृति और एक मुसीबत का इशारा inducible प्रोटीन में पर ध्यान केंद्रित<em> बेसिलस subtilis</em>. यहाँ वर्णित प्रक्रियाओं के सभी आसानी से इमेजिंग बैक्टीरियल प्रजातियों की एक किस्म में प्रोटीन परिसरों के लिए उत्तरदायी हैं.

Protocol

माइक्रोस्कोपी के लिए कोशिकाओं के बढ़ते संस्कृतियों 1. इमेजिंग के लिए पहले एक या दो दिन, बी तैयार subtilis आप कल्पना करना चाहते हैं translational संलयन प्रोटीन युक्त तनाव. कदम 1A और 1B के ट्रायल के दौर जो ?…

Discussion

परीक्षण और त्रुटि के लिए प्रत्येक तनाव के लिए उच्चतम गुणवत्ता छवियों के लिए जोखिम की स्थिति को खोजने के लिए आवश्यक हैं, हम पाते हैं कि एक millisecond सफेद प्रकाश छवियों के लिए उपयुक्त है, जबकि 100 से 2000 एमएस के जोख?…

Materials

Specific solution recipes¹:

10x S7₅₀ salts
0.5 M MOPS
100 mM Ammonium Sulfate
50 mM Potassium Phosphate Monobasic
Filter sterilize, and wrap S7₅₀ media in foil prior to storage

100x Metals
0.2 M MgCl₂
70 mM CaCl₂
5 mM MnCl₂
0.1 mM ZnCl₂
100 μg/mL Thiamine HCl
2 mM HCl
0.5 mM FeCl₃*
dH₂O to final volume
*FeCl₃ should be added last, to prevent precipitation.
After filter sterilization, wrap 100x Metal solution in foil.

S7₅₀ media
1x S7₅₀ salts
1x Metal
1% Glucose
0.1% Glutamate
40 μg/mL Tryptophan
40 μg/mL Phenylalanine
distilled H₂O to final volume

10x Spizizens (grams/L)
151.4 mM Ammonium Sulfate (20g/L)
803.8 mM Potassium Phosphate Monobasic (140g/L)
440.9 mM Potassium Phosphate Dibasic (60g/L)
34.0 mM Sodium Citrate (10g/L)
16.6 mM MgSO₄ (2g/L)
dH₂O to final volume
Filter sterilize