イメージングのミスマッチ修復とのDNA損傷に対する細胞応答枯草菌</em

Summary

詳細なプロトコルは、イメージングのためのDNA修復複合体のリアルタイムの形成を説明しています<em>枯草菌</em>細胞。

Abstract

原核生物と真核生物の両方の生理的変化の複雑なセットを介してDNA損傷に応答する。遺伝子発現、既存の蛋白質の再分配、及び新たなタンパク質複合体のアセンブリの変化は、DNAの損傷とミスマッチDNAの塩基対の種々の方法によって刺激することができる。蛍光顕微鏡は、DNA損傷にと生きている細胞の複雑な細胞内のアーキテクチャの中でDNAの複製の状態を監視するために、これらおよび他の応答を可視化し定量化するための強力な実験ツールとして用いられている。蛍光レポータータンパク質とDNA複製と修復機構のコンポーネント間の翻訳融合は、手がかりを決定するために使用されているその同族病変の標的DNA修復タンパク質<em> in vivoで</em>そしてこれらのタンパク質が細菌細胞内で編成されているかを理解する。さらに、DNA損傷誘導性プロモーターに連結された転写と翻訳融合は、集団内の細胞は遺伝毒性ストレス応答を活性化されているいるを明らかにした。このレビューでは、我々は、画像にDNAの修復と、単一の細菌細胞のDNA複製複合体のアセンブリを蛍光顕微鏡を使用するための詳細なプロトコルを提供しています。特に、この作品は、イメージングのミスマッチ修復タンパク質、相同組換え、DNA複製とSOS誘導性蛋白質の焦点を当て<em>枯草菌</em>。ここで説明する手順のすべては、細菌種の様々なイメージングのタンパク質複合体に対して容易に適している。

Protocol

顕微鏡の細胞の成長文化 1。一または二日には、イメージングの前に、Bを用意する枯草菌では、可視化したい翻訳融合タンパク質を含む菌株。ステップ1Aおよび1Bの試験のラウンドは、成長条件があなたの株の最高の画像を提供しているかを判断するために必要となります。ほとんどの場合、細胞は対数増殖期の間に撮像することがあります。 <ol class="ualpha…

Discussion

試行錯誤は、各株の最高品質の画像の露光条件を見つけるために必要とされ、我々は100〜2000ミリ秒のエクスポージャーはGFP（FITC）とFM4 – 64（TRITCに適している間に1ミリ秒は、白色光の画像に適していることを見つける）のイメージ。露光時間は、使用するイメージング機器によって異なります。複数の系統が同じスライド上に存在する場合、パッドの国境から細胞のパッドの品質と拡散は、…

Materials

Specific solution recipes¹:

10x S7₅₀ salts
0.5 M MOPS
100 mM Ammonium Sulfate
50 mM Potassium Phosphate Monobasic
Filter sterilize, and wrap S7₅₀ media in foil prior to storage

100x Metals
0.2 M MgCl₂
70 mM CaCl₂
5 mM MnCl₂
0.1 mM ZnCl₂
100 μg/mL Thiamine HCl
2 mM HCl
0.5 mM FeCl₃*
dH₂O to final volume
*FeCl₃ should be added last, to prevent precipitation.
After filter sterilization, wrap 100x Metal solution in foil.

S7₅₀ media
1x S7₅₀ salts
1x Metal
1% Glucose
0.1% Glutamate
40 μg/mL Tryptophan
40 μg/mL Phenylalanine
distilled H₂O to final volume

10x Spizizens (grams/L)
151.4 mM Ammonium Sulfate (20g/L)
803.8 mM Potassium Phosphate Monobasic (140g/L)
440.9 mM Potassium Phosphate Dibasic (60g/L)
34.0 mM Sodium Citrate (10g/L)
16.6 mM MgSO₄ (2g/L)
dH₂O to final volume
Filter sterilize