Um protocolo detalhado é descrito para a formação de imagem em tempo real de complexos de reparo de DNA em<em> Bacillus subtilis</em> Células.
Abstract
Ambos os procariotas e eucariotas responder a danos no DNA através de um complexo conjunto de alterações fisiológicas. Alterações na expressão gênica, a redistribuição de proteínas existentes, ea montagem de complexos de proteínas novo pode ser estimulada por uma variedade de lesões de DNA e de pares de bases incompatíveis DNA. Microscopia de fluorescência tem sido utilizada como uma poderosa ferramenta experimental para visualizar e quantificar as respostas para essas e outras lesões de DNA e para monitorar o status de replicação de DNA dentro da complexa arquitetura subcelular de uma célula viva. Fusões de translação entre proteínas fluorescentes e componentes repórter da replicação do DNA e máquinas de reparação têm sido usados para determinar as sugestões que visam as proteínas do reparo do DNA de suas lesões cognate<em> In vivo</em> E para entender como essas proteínas são organizados dentro das células bacterianas. Além disso, fusões de transcrição e translação ligadas a promotores de DNA induzida danos revelaram que as células dentro de uma população de ter activado as respostas ao estresse genotóxico. Nesta revisão, nós fornecemos um protocolo detalhado para o uso de microscopia de fluorescência para a imagem da montagem de reparo de DNA e complexos de DNA de replicação em single células bacterianas. Em particular, este trabalho se concentra em proteínas incompatibilidade imagem reparo, recombinação homóloga, a replicação de DNA e uma proteína induzível SOS-in<em> Bacillus subtilis</em>. Todos os procedimentos aqui descritos são facilmente passíveis de complexos de proteínas de imagens em uma variedade de espécies bacterianas.
Protocol
Culturas em crescimento de células para microscopia 1. Um ou dois dias antes da imagem, prepare o B. subtilis cepa contendo a proteína de fusão traducional você deseja visualizar. Rounds julgamento de passos 1A e 1B será necessário determinar qual condição de crescimento fornece as melhores imagens da sua estirpe. Na maioria dos casos, as células devem ser trabalhada durante a fase de crescimento exponencial. Para alguns B. subtilis cepas …
Discussion
Tentativa e erro são necessários para encontrar as condições de exposição de imagens da mais alta qualidade para cada cepa, e supomos que 1 milissegundo é apropriado para imagens com luz branca, enquanto exposições de 100 a 2000 ms são apropriados para GFP (FITC) e FM4-64 (TRITC ) imagens. Tempo de exposição vai variar dependendo do equipamento de imagem utilizada. Recomendamos o uso de uma cepa por 15 bem-lâmina de microscópio para a imagem mais simples, como a qualidade pad e difusão de células da fron…
Acknowledgements
Os autores gostariam de agradecer as Dras. Philina S. Lee e Alan D. Grossman para a formação inicialmente LAS em microscopia de fluorescência. Os autores também agradecer as Dras. Melanie Berkmen e Hajime Kobayashi para a ajuda e dicas para a imagem latente. Este trabalho foi financiado por fundos start-up da Faculdade de Literatura, Ciência e Artes e do Departamento de Biologia Molecular, Celular e do Desenvolvimento na Universidade de Michigan.
Materials
Specific solution recipes1:
10x S750 salts
0.5 M MOPS
100 mM Ammonium Sulfate
50 mM Potassium Phosphate Monobasic
Filter sterilize, and wrap S750 media in foil prior to storage
100x Metals
0.2 M MgCl2
70 mM CaCl2
5 mM MnCl2
0.1 mM ZnCl2
100 μg/mL Thiamine HCl
2 mM HCl
0.5 mM FeCl3*
dH2O to final volume
*FeCl3 should be added last, to prevent precipitation.
After filter sterilization, wrap 100x Metal solution in foil.
S750 media
1x S750 salts
1x Metal
1% Glucose
0.1% Glutamate
40 μg/mL Tryptophan
40 μg/mL Phenylalanine
distilled H2O to final volume
10x Spizizens (grams/L)
151.4 mM Ammonium Sulfate (20g/L)
803.8 mM Potassium Phosphate Monobasic (140g/L)
440.9 mM Potassium Phosphate Dibasic (60g/L)
34.0 mM Sodium Citrate (10g/L)
16.6 mM MgSO4 (2g/L)
dH2O to final volume
Filter sterilize
Klocko, A. D., Crafton, K. M., Walsh, B. W., Lenhart, J. S., Simmons, L. A. Imaging Mismatch Repair and Cellular Responses to DNA Damage in Bacillus subtilis. J. Vis. Exp. (36), e1736, doi:10.3791/1736 (2010).