Dechiffrera axonal vägar genetiskt definierade grupper av nervceller i Chick Neural Tube Använda I ovo Elektroporation
Summary
Denna video visar hur du visualisera axonal vägar genetiskt definierade grupper av nervceller i embryonala ungen ryggmärgen att utnyttja<em> I ovo</em> Elektroporation av reporter gener under kontroll av specifika enhancer element.
Abstract
Anställning av förstärkare element för att driva uttryck av reportern gener i nervceller är en allmänt använd paradigm för spårning axonal projektion. För spårning axonal projicering av spinal interneuronen hos ryggradsdjur, könscellernas riktade reporter gener ger bilateralt symmetrisk märkning. Därför är det svårt att skilja mellan ipsi-och kontraindikationer sidled utskjutande axoner. Ensidig elektroporation i ungen neuralröret ger ett användbart sätt att begränsa uttrycket av en reporter gen till ena sidan av det centrala nervsystemet, och att följa axonal projektion på båda sidor<sup> 1 ,2-5</sup>. Denna video visar först hur att hantera äggen före injektion. Vid HH stadium 18-20, är DNA injiceras i sakrala nivån på neuralröret, då volframelektroder placeras parallellt med embryot och korta elektriska pulser ges tillsammans med en pulsgenerator. Ägget är förseglade med tejp och läggs tillbaka i en inkubator för vidare utveckling. Tre dagar senare (E6) är ryggmärgen bort som en öppen bok förberedelse från embryo, fast, och behandlas för hela berget antikroppar färgning. Den färgade ryggmärgen är monterad på bilden och visualiseras med hjälp av konfokalmikroskopi.
Protocol
Discussion
Elektroporation av plasmid DNA i kycklingembryo utvecklas som en kraftfull teknik för in vivo ektopiska uttryck. Kombinationen av specifika medel, och bruden elektroporation ger en snabb och effektivt verktyg för att dechiffrera axonal vägar av en genetiskt definierad grupp av nervceller 1,3,5. Använda Cre / LoxP och Gal4/UAS system förstärkningen kan öka nivåerna och varaktigheten av uttryck. Den nya bilden är av en komplex skillnaderna mellan axonal signaler som uppstår interneuron subpopulationer…
Acknowledgements
Detta arbete har finansierats med bidrag till AK från Israel Science Foundation, Israel hälsoministeriet och DFG (tyska forskningsstiftelsen).
References
- Zisman, S., et al. Proteolysis and membrane capture of F-spondin generates combinatorial guidance cues from a single molecule. J Cell Biol. 178 (7), 1237-1249 (2007).
- Arakawa, T., Iwashita, M., Matsuzaki, F., Suzuki, T., Yamamoto, T. Paths, elongation, and projections of ascending chick embryonic spinal commissural neurons after crossing the floor plate. Brain Res. 1223, 25-33 (2008).
- Avraham, O., et al. Transcriptional control of axonal guidance and sorting in dorsal interneurons by the Lim-HD proteins Lhx9 and Lhx1. Neural Dev. 4 (1), 21 (2009).
- Timmer, J., Johnson, J., Niswander, L. The use of in ovo electroporation for the rapid analysis of neural-specific murine enhancers. Genesis. 29 (3), 123-132 (2001).
- Reeber, S. L., et al. Manipulating Robo expression in vivo perturbs commissural axon pathfinding in the chick spinal cord. J Neurosci. 28 (35), 8698-8708 (2008).
