Descifrar Caminos axonal de los grupos definidos genéticamente las neuronas en el tubo neural del polluelo Utilizando In ovo La electroporación
Summary
Este video muestra la forma de visualizar las vías axonales de grupos genéticamente definidos de neuronas en la médula espinal de embriones de pollo que utilizan<em> In ovo</em> Electroporación de los genes reportero bajo el control de determinados elementos potenciadores.
Abstract
El empleo de elementos potenciadores para dirigir la expresión de genes reporteros en las neuronas es un paradigma ampliamente utilizado para el seguimiento de la proyección axonal. Para el seguimiento de la proyección axonal de interneuronas espinales en los vertebrados, la línea germinal objetivo genes reportero de etiquetado sobre simetría bilateral. Por lo tanto, es difícil distinguir entre la ipsi y contra-lateral se proyecta axones. Electroporación unilateral en el tubo neural de pollo proporciona un medio útil para limitar la expresión de un gen a un lado del sistema nervioso central, y de seguir la proyección axonal en ambos lados<sup> 1 ,2-5</sup>. Este video muestra primero cómo manejar los huevos antes de la inyección. HH en la etapa 18-20, el ADN es inyectado en el nivel sacro del tubo neural, a continuación, los electrodos de tungsteno se colocan en paralelo al embrión y cortos impulsos eléctricos se administran con un generador de pulsos. El huevo es sellada con cinta adhesiva y se coloca de nuevo en una incubadora para un mayor desarrollo. Tres días más tarde (E6) de la médula espinal se retira como un libro abierto de la preparación de embriones, fija, y procesados para la tinción de anticuerpos conjunto de montaje. La médula espinal teñido se monta en la diapositiva y se visualiza mediante microscopía confocal.
Protocol
Discussion
Electroporación de ADN plásmido en el embrión de pollo se desarrolla como una técnica de gran alcance para la expresión ectópica en vivo. La combinación de potenciadores específicos, y la electroporación de pollo proporciona una herramienta rápida y eficaz para descifrar las vías axonal de un grupo definido genéticamente las neuronas 1,3,5. Utilizando el cre / loxP y los sistemas de amplificación GAL4/UAS puede aumentar los niveles y duración de la expresión. El panorama resultante es el de una…
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado por becas de la Fundación de AK Israel Ciencia, el Ministerio de Salud de Israel, y la DFG (Fundación Alemana de Investigación).
References
- Zisman, S., et al. Proteolysis and membrane capture of F-spondin generates combinatorial guidance cues from a single molecule. J Cell Biol. 178 (7), 1237-1249 (2007).
- Arakawa, T., Iwashita, M., Matsuzaki, F., Suzuki, T., Yamamoto, T. Paths, elongation, and projections of ascending chick embryonic spinal commissural neurons after crossing the floor plate. Brain Res. 1223, 25-33 (2008).
- Avraham, O., et al. Transcriptional control of axonal guidance and sorting in dorsal interneurons by the Lim-HD proteins Lhx9 and Lhx1. Neural Dev. 4 (1), 21 (2009).
- Timmer, J., Johnson, J., Niswander, L. The use of in ovo electroporation for the rapid analysis of neural-specific murine enhancers. Genesis. 29 (3), 123-132 (2001).
- Reeber, S. L., et al. Manipulating Robo expression in vivo perturbs commissural axon pathfinding in the chick spinal cord. J Neurosci. 28 (35), 8698-8708 (2008).
