電子線結晶学による構造生物学研究用小型膜タンパク質の二次元結晶化トライアルの評価
Summary
注文した膜タンパク質アレイの形成のために2次元（2D）の結晶化試験を評価すると、電子線結晶学における非常に重要かつ困難な作業です。 90kDa – ここでは、のためにスクリーニングし、15の範囲で主に小型の膜タンパク質の2次元結晶の同定に我々のアプローチを説明します。
Abstract
電子線結晶学は、どちらかあるいは、または構造と機能膜タンパク質の質問だけでなく、可溶性タンパク質を研究するために三次元結晶化とX線結晶構造解析と組み合わせて使用することができる手法として発展してきた。透過型電子顕微鏡による二次元（2D）の結晶のスクリーニングは、（EM）を最適化し、低温電子顕微鏡による高分解能のデータ収集のためのサンプルを選択し、見つけるのに重要なステップです。ここでは、潜在的に結晶化条件の最適化に重要な情報を供給できるよう、大規模および順序だけでなく、小規模な2次元配列の両方を識別するための基本的な手順を説明します。
EMで異なる倍率で作業することによって、重要なパラメータの範囲のデータが得られる。低倍率では、形態や膜サイズで貴重なデータを提供しています。より高い倍率で、可能な限り順番と二次元結晶の寸法が決定されます。この文脈では、CCDカメラとオンライン – フーリエ変換は、順序とサイズのためのプロテオリポソームを評価するために高倍率で使用されているか説明しています。
膜タンパク質の2次元結晶は、最も一般的に透析して再構成によって栽培されているが、スクリーニングの手法は、単層、ネイティブの2Dクリスタルの助けを借りて生産結晶の等しく適用可能である、と可溶性タンパク質の配列を命じた。さらに、ここで説明する方法は、さらに小さいの2D結晶だけでなく、私たちの例と大規模なタンパク質の格子がより容易に識別できる可能性があるとしても小さい蛋白質が同定におけるケアの同じ量を必要とする大規模な膜タンパク質のスクリーニングに適用可能である審査の早い段階で。
Protocol
Discussion
サンプルの適切な評価は、膜の十分な数の慎重な評価が必要です。例えば、180以上の画像化されたプロテオリポソームの外のような低％2などの結晶配列を持つ試料は二次元結晶化の条件7の迅速な最適化のための重要な情報を与えた。
タンパク質の時折部分的沈殿が発生したものの、タンパク質の沈殿が発生すると、グリッドは、低倍率での検査の後、さらにス?…
Acknowledgements
我々は我々の方法に関連する経験と観察のいくつかに貢献し、貴重なタンパク質サンプルを、提供するための私達の協力者に感謝する。ギュンターSchmalzingは親切にこのプロジェクトに参加するFRする機会を提供した。バーバラArmbruster氏、ヤコブブリンクとデリックミルズは、その卓越したヘルプや機器の入力のために感謝されています。資金は、NIHの助成金HL090630によって提供されていました。
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| 400-mesh copper TEM grids coated with carbon film | ||||
| forceps: regular and anti-capillary | Dumont #5 and Dumont N5AC or similar | |||
| Micropipette and pipette tips | ||||
| Whatman #4 filter paper | ||||
| 1% uranyl acetate | ||||
| Dialysis sample to be screened for 2D crystals | ||||
| Glycerol/sucrose-free dialysis buffer | Optional | |||
| JEOL-1400 transmission electron microscope (TEM) | similar 80 – 120kV TEM equipped with an Lab6 or tungsten filament and film and/or CCD cameras (Gatan Orius SC1000 and/or UltraScan1000 CCD cameras and Gatan Digitial Micrograph software package or Tietz cameras (TVIPS)) |
References
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