Identificação de fenótipos inibição do crescimento induzido pela expressão de Effectors Tipo III bacteriana em Yeast
Summary
Neste vídeo, descrevemos um procedimento para a expressão de efetores tipo bacteriana III em levedura ea identificação de fenótipos efetoras induzida por inibição do crescimento. Esses fenótipos podem ser posteriormente explorada para elucidar funções efetoras e metas.
Abstract
Muitas bactérias Gram-negativas patogénicas usam um sistema de secreção do tipo III para translocar um conjunto de proteínas efetoras para o citosol das células do hospedeiro. Dentro da célula, effectors tipo III subverter processos de celular do hospedeiro para suprimir a resposta imunológica e promover o crescimento de patógenos. Efetores tipo numerosos III de plantas e animais patógenos bacterianos foram identificados até o momento, mas apenas alguns deles estão bem caracterizadas. Compreender as funções destes efetores tem sido prejudicada por uma combinação de redundância funcional no repertório efetoras de uma cepa bacteriana dadas, os efeitos sutis que podem exercer para aumentar a virulência, os papéis que são, possivelmente, específicos para estágios determinada infecção, e dificuldades no geneticamente manipulação de certos patógenos. Expressão de efetores tipo III na levedura de brotamento<em> Saccharomyces cerevisiae</em> Pode permitir contornar estas limitações e ajuda para a caracterização funcional de proteínas efetoras. Porque effectors tipo III muitas vezes alvo de processos celulares que são conservados entre leveduras e outros eucariotos, sua expressão em levedura pode resultar em fenótipos inibição de crescimento que pode ser explorada para elucidar funções efetoras e metas. Vantagens adicionais ao uso de fermento para estudos funcionais de efetores bacteriana incluem sua docilidade genético, informações sobre as funções previstas da grande maioria de suas ORFs, e disponibilidade de várias ferramentas e recursos para experiências tanto do genoma e em pequena escala. Aqui vamos discutir os fatores críticos para a concepção de um sistema de levedura para a expressão de proteínas do tipo bacteriana III efetoras. Estes incluem um promotor apropriado para dirigir a expressão do gene efetor (s) de interesse, o número de cópias do gene efetor, o tag epítopo usado para verificar a expressão da proteína, ea cepa de levedura. Apresentamos os procedimentos de induzir a expressão de efetores em leveduras e verificar a sua expressão por immunoblotting. Além disso, descrevemos um ensaio de spotting em placas de agar para a identificação de fenótipos efetoras induzida por inibição do crescimento. O uso deste protocolo pode ser prorrogado para o estudo de fatores de patogenicidade entregue na célula hospedeira por qualquer patógeno e mecanismo de translocação.
Protocol
Discussion
Nesta apresentação, ilustramos como usar o brotamento levedura Saccharomyces cerevisiae como um sistema heterólogo para a expressão do tipo III bacteriana proteínas efetoras e como identificar efetoras induzida fenótipos inibição do crescimento. Importante, esses fenótipos podem ser utilizados em telas genéticos para identificar os supressores do impacto negativo sobre o crescimento de efetores levedura. Supressores pode representar tanto alvos diretos da efetoras estudadas ou proteínas que participa…
Acknowledgements
Este trabalho foi financiado pela Fundação Ciência Israel.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Yeast extract | Difco | 212750 | ||
| Peptone | Difco | 211677 | ||
| D-glucose | Sigma | G5767 | ||
| Agar | Difco | 214010 | ||
| Sodium hydroxide (NaOH) | Sigma | S8045 | ||
| Yeast nitrogen base w/o amino acids | Difco | 291940 | ||
| Yeast synthetic drop-out medium supplement | Sigma | Y2001 | ||
| D-galactose | Sigma | G0750 | >99%; <0.1% glucose | |
| D-raffinose | Sigma | R0250 | >98% | |
| L-leucine | Sigma | L8000 | ||
| Uracil | Sigma | U0750 | ||
| L-tryptophan | Sigma | T0254 | ||
| L-histidine | Sigma | H6034 | ||
| DNA, single stranded, from salmon testes | Sigma | D7656 | ||
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma | D5879 | Desiccate | |
| Hydrochloric acid (HCl) | Sigma | H1758 | ||
| Polyethylene glycol (PEG) 3350 | Sigma | P4338 | ||
| Lithium acetate (LiAc) | Sigma | L4958 | ||
| Tris (base) | J.T. Baker | 4109-02 | ||
| Ethylenediamine-tetraacetic acid (EDTA) | Sigma | E5134 | ||
| β-mercaptoethanol | Sigma | M6250 | ||
| Glycerol | Sigma | G5516 | ||
| Bromophenol blue | Sigma | B6131 | ||
| Dodecyl sulfate sodium salt (SDS) | Merck | 8.22050.1000 | ||
| Centrifuge tubes (15 ml) | Corning | 430052 | Sterile | |
| Spectrophotometer cuvette (10x4x45 mm) | Sarstedt | 67.742 | ||
| Inoculation loop | Sigma | Z643009 | Sterile | |
| Parafilm | Sigma | P7543 | ||
| pH indicator strip, pH 6.5-10.0 | Merck | 1.09543.0001 |
References
- Siggers, K. A., Lesser, C. F. The yeast Saccharomyces cerevisiae: a versatile model system for the identification and characterization of bacterial virulence proteins. Cell Host Microbe. 4, 8-15 (2008).
- Parsons, A. B. Integration of chemical-genetic and genetic interaction data links bioactive compounds to cellular target pathways. Nat. Biotechnol. 22, 62-69 (2004).
- Munkvold, K. R., Martin, M. E., Bronstein, P. A., Collmer, A. A survey of the Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000 type III secretion system effector repertoire reveals several effectors that are deleterious when expressed in Saccharomyces cerevisiae. Mol. Plant-Microbe Interact. 21, 490-502 (2008).
- Curak, J., Rohde, J., Stagljar, I. Yeast as a tool to study bacterial effectors. Curr. Opin. Microbiol. 12, 18-23 (2009).
- Slagowski, N. L., Kramer, R. W., Morrison, M. F., LaBaer, J., Lesser, C. F. A functional genomic yeast screen to identify pathogenic bacterial proteins. PLoS Pathog. 4, e9-e9 (2008).
- Huang, J., Lesser, C. F., Lory, S. The essential role of the CopN protein in Chlamydia pneumoniae intracellular growth. Nature. 456, 112-115 (2008).
