성장 저해 Phenotypes의 확인은 효모에서 세균의 종류 III Effectors 표현에 의해 유도된
Summary
이 비디오에서는, 우리는 효모와 효과기 유발 성장 저해 phenotypes의 식별에 세균성 유형 III의 effectors의 표현을위한 절차를 설명합니다. 이러한 phenotypes는 이후 이펙터 기능과 목표를 명료하게하다에 악용될 수 있습니다.
Abstract
많은 그람 음성 병원성 박테리아는 호스트 세포의 cytosol에 효과기 단백질의 제품군을 이동시키다하는 유형 III 분비 시스템을 사용합니다. 세포 내에서 입력 III의 effectors는 면역 반응을 억제하고 병원균의 성장을 촉진하기 위해 호스트 세포 프로세스를 파괴. 식물과 동물 세균성 병원균의 많은 유형 III의 effectors는 날짜에 확인되었습니다, 아직 그들의 몇 잘 묘사하고 있습니다. 이러한 effectors의 기능을 이해하는 것은 특정 박테리아 변종의 효과기 레퍼토리의 기능 중복의 조합에 의해 손상되어, 그들은 독성, 특정 감염 단계로 가능 구체적인 역할, 그리고 유전의 어려움을 증가 견딜수 수있는 미묘한 효과 특정 병원균을 조작. 신진 효모 입력 III effectors의 표현<em> Saccharomyces cerevisiae</em> 효과기 단백질의 기능 특성 이러한 제한 및 지원을 우회 수 있습니다. 유형 III의 effectors 자주 효모 및 기타 eukaryotes 사이의 보존 아르 세포 프로세스를 타겟으로하기 때문에, 효모 그들의 표정은 효과기 기능과 목표를 명료하게하다에 악용될 수있는 성장 저해 phenotypes 발생할 수 있습니다. 세균성 effectors의 기능 연구를위한 효모를 사용하여 추가 장점은 자신의 유전자 tractability, 그들의 ORFs의 대부분의 예측 기능에 대한 정보, 그리고 게놈 차원 및 소규모 모두 실험에 대한 여러 도구와 리소스의 가용성을 포함합니다. 여기 세균 유형 III 효과기 단백질의 표현을위한 효모 시스템을 설계 중요한 요인을 논의합니다. 이들은 관심의 효과기 유전자 (들)의 표현을 운전에 적합한 발기인을 포함, 효과기 유전자의 사본 번호는 에피토프 태그는 단백질 표현, 그리고 효모 변형을 확인하는 데 사용됩니다. 우리는 효모에서 effectors의 표현을 유도하고 immunoblotting함으로써 표현을 확인하는 절차를 제시한다. 또한, 우리는 효과기 유발 성장 저해 phenotypes의 식별을위한 한천 플레이트에 야생 분석을 설명합니다. 이 프로토콜의 사용은 어떤 병원체와 translocation 메커니즘에 의해 숙주 세포에 전달 pathogenicity 요인의 연구에 확장된 수 있습니다.
Protocol
Discussion
이 프레 젠 테이션에서, 우리는 유형 III 세균 효과기 단백질 및 효과기 유발 성장 저해 phenotypes을 식별의 표현을위한 heterologous 시스템으로 신진 효모 Saccharomyces cerevisiae의 사용 방법을 설명 하였다. 중요한 것은 이러한 phenotypes는 효모의 성장에 effectors의 부정적인 영향의 진압을 식별하는 유전자 화면에서 이용하실 수 있습니다. 진압 장치가 직접 공부 이펙터의 대상이나 이펙터…
Acknowledgements
이 작품은 이스라엘 과학 재단에 의해 지원되었다.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Yeast extract | Difco | 212750 | ||
| Peptone | Difco | 211677 | ||
| D-glucose | Sigma | G5767 | ||
| Agar | Difco | 214010 | ||
| Sodium hydroxide (NaOH) | Sigma | S8045 | ||
| Yeast nitrogen base w/o amino acids | Difco | 291940 | ||
| Yeast synthetic drop-out medium supplement | Sigma | Y2001 | ||
| D-galactose | Sigma | G0750 | >99%; <0.1% glucose | |
| D-raffinose | Sigma | R0250 | >98% | |
| L-leucine | Sigma | L8000 | ||
| Uracil | Sigma | U0750 | ||
| L-tryptophan | Sigma | T0254 | ||
| L-histidine | Sigma | H6034 | ||
| DNA, single stranded, from salmon testes | Sigma | D7656 | ||
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma | D5879 | Desiccate | |
| Hydrochloric acid (HCl) | Sigma | H1758 | ||
| Polyethylene glycol (PEG) 3350 | Sigma | P4338 | ||
| Lithium acetate (LiAc) | Sigma | L4958 | ||
| Tris (base) | J.T. Baker | 4109-02 | ||
| Ethylenediamine-tetraacetic acid (EDTA) | Sigma | E5134 | ||
| β-mercaptoethanol | Sigma | M6250 | ||
| Glycerol | Sigma | G5516 | ||
| Bromophenol blue | Sigma | B6131 | ||
| Dodecyl sulfate sodium salt (SDS) | Merck | 8.22050.1000 | ||
| Centrifuge tubes (15 ml) | Corning | 430052 | Sterile | |
| Spectrophotometer cuvette (10x4x45 mm) | Sarstedt | 67.742 | ||
| Inoculation loop | Sigma | Z643009 | Sterile | |
| Parafilm | Sigma | P7543 | ||
| pH indicator strip, pH 6.5-10.0 | Merck | 1.09543.0001 |
References
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