酵母の菌タイプIIIエフェクターの発現により誘導される増殖阻害表現型の同定
Summary
このビデオでは、我々は酵母における細菌のタイプIIIエフェクターの発現とエフェクター誘導性成長抑制の表現型を同定するための手順を説明します。そのような表現型は、その後、エフェクター機能と目標を明らかにするために悪用される可能性があります。
Abstract
多くのグラム陰性病原性細菌は、宿主細胞のサイトゾルへエフェクタータンパク質のスイートを転位するタイプIII分泌系を使用してください。セル内で、タイプIIIエフェクターの免疫応答を抑制し、病原体の成長を促進するため、ホスト細胞プロセスを破壊する。植物と動物の細菌性病原体の多数のタイプIIIエフェクターは、これまでに同定されており、まだそのうちのほんの数は十分に特徴付けされています。これらのエフェクターの機能を理解するために、彼らは病原性、特定の感染症の段階におそらく固有の役割、および遺伝的に困難を増加させる及ぼす可能性があることを微妙な効果は、特定の細菌株のエフェクターレパートリーの中で機能的な冗長性の組み合わせによって損なわれている特定の病原体を操作する。出芽酵母におけるタイプIIIエフェクターの発現<em>サッカロマイセスセレビシエ</em>エフェクタータンパク質の機能解析にこれらの制限と援助を回避できる場合があります。 III型エフェクターはしばしば酵母や他の真核生物間で保存されている細胞プロセスを標的とするので、酵母での発現は、エフェクター機能と目標を明らかにするために悪用される可能性の成長阻害表現型になることがあります。細菌のエフェクターの機能研究のために酵母を使用する付加的な利点は、彼らの遺伝的従順さ、予測、そのORFの大部分の機能、およびゲノムワイドの両方と小規模な実験のための多数のツールやリソースの可用性に関する情報が含まれています。ここでは、細菌のタイプIIIエフェクタータンパク質の発現のために酵母のシステムを設計するための重要な要因について説明します。これらは、興味のエフェクター遺伝子（S）、エフェクター遺伝子、タンパク質の発現を確認するために使用されるエピトープタグ、及び酵母菌株のコピー数の発現を駆動するための適切なプロモーターが含まれています。我々は酵母におけるエフェクターの発現を誘導し、免疫ブロッティングによりその発現を確認する手順を提示する。さらに、我々はエフェクター誘導性成長抑制の表現型の識別のための寒天プレート上にスポッティングアッセイを説明します。このプロトコルの使用は、いかなる病原体と転座機構により宿主細胞に送達病原性因子の研究に延長することができる。
Protocol
Discussion
本発表では、我々は、III型細菌のエフェクタータンパク質とどのようにエフェクター誘導性成長抑制の表現型を識別するための発現のための異種システムとして、出芽酵母の出芽酵母を使用する方法を示します。重要なことは、これらの表現型は、酵母の増殖に対するエフェクターの負の影響の抑制を識別するための遺伝子スクリーニングに利用することができます。サプレッサは、?…
Acknowledgements
この作品は、イスラエル科学財団によってサポートされていました。
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Yeast extract | Difco | 212750 | ||
| Peptone | Difco | 211677 | ||
| D-glucose | Sigma | G5767 | ||
| Agar | Difco | 214010 | ||
| Sodium hydroxide (NaOH) | Sigma | S8045 | ||
| Yeast nitrogen base w/o amino acids | Difco | 291940 | ||
| Yeast synthetic drop-out medium supplement | Sigma | Y2001 | ||
| D-galactose | Sigma | G0750 | >99%; <0.1% glucose | |
| D-raffinose | Sigma | R0250 | >98% | |
| L-leucine | Sigma | L8000 | ||
| Uracil | Sigma | U0750 | ||
| L-tryptophan | Sigma | T0254 | ||
| L-histidine | Sigma | H6034 | ||
| DNA, single stranded, from salmon testes | Sigma | D7656 | ||
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma | D5879 | Desiccate | |
| Hydrochloric acid (HCl) | Sigma | H1758 | ||
| Polyethylene glycol (PEG) 3350 | Sigma | P4338 | ||
| Lithium acetate (LiAc) | Sigma | L4958 | ||
| Tris (base) | J.T. Baker | 4109-02 | ||
| Ethylenediamine-tetraacetic acid (EDTA) | Sigma | E5134 | ||
| β-mercaptoethanol | Sigma | M6250 | ||
| Glycerol | Sigma | G5516 | ||
| Bromophenol blue | Sigma | B6131 | ||
| Dodecyl sulfate sodium salt (SDS) | Merck | 8.22050.1000 | ||
| Centrifuge tubes (15 ml) | Corning | 430052 | Sterile | |
| Spectrophotometer cuvette (10x4x45 mm) | Sarstedt | 67.742 | ||
| Inoculation loop | Sigma | Z643009 | Sterile | |
| Parafilm | Sigma | P7543 | ||
| pH indicator strip, pH 6.5-10.0 | Merck | 1.09543.0001 |
References
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