La transplantation de blastomères exprimant la GFP pour l'imagerie en direct sur le développement de la rétine et du cerveau dans les embryons de poissons zèbres chimériques
Summary
Nous démontrons un protocole visant à générer des embryons de poissons zèbres chimérique pour l'imagerie cellulaire comportements direct durant l'embryogenèse.
Abstract
Cellules changement abondamment dans leurs emplacements et des biens lors de l'embryogenèse. Ces changements sont réglementés par les interactions entre les cellules et leur environnement. Embryons chimériques, qui sont composés de cellules du fond génétique différent, sont d'excellents outils pour étudier les interactions cellule-cellule médiée par des gènes d'intérêt. La transparence des embryons de poisson zèbre au premiers stades de développement permet la visualisation directe de la morphogenèse des tissus et des organes au niveau cellulaire. Ici, nous démontrons un protocole visant à générer des rétines chimérique et le cerveau chez l'embryon de poisson zèbre et d'effectuer l'imagerie en direct de cellules du donneur. Le protocole couvre la préparation des aiguilles greffe, la transplantation de blastomères exprimant la GFP donateurs à la GFP-négatif hôtes, et l'examen du comportement des cellules des donneurs en microscopie confocale vivre. Avec de légères modifications, ce protocole peut également être utilisée pour étudier le développement embryonnaire des autres tissus et organes chez le poisson zèbre. Les avantages d'utiliser la GFP aux cellules du donneur d'étiquettes sont également discutés.
Protocol
Discussion
Dans cette vidéo, nous démontrons une méthode pour la transplantation blastomère d'analyser le développement de la rétine et du cerveau chez le poisson zèbre. Ce protocole peut également être utilisé pour analyser le développement des autres tissus et organes, simplement en libérant les blastomères donateurs à des emplacements correspondants dans les embryons hôte. L'étiquetage avec des molécules GFP donne un nettoyant de fond que l'étiquetage avec colorant fluorescent conjugué Dextran (Ho…
Acknowledgements
Cette étude a été soutenue par un National Institutes of Health (NIH) Core Grant (5P30EY008098) et les fonds suivants au XW: des subventions du NIH et de la Recherche R01EY016099 visant à prévenir la cécité Prix du développement de carrière. Nous remercions Lathrop Kira à l'aide de l'imagerie confocale.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| 5 ¾” Glass pipette | Fisher Scientific | 13-678-30 | ||
| Borosilicate Glass Capillary | WPI (World Precision Instruments, Inc.) | 1B100F-4 | ||
| FluoroDish | WPI | FD35 | ||
| Vertical Needle / pipette Puller | David Kopf Instruments | Model 720 | ||
| Micro Grinder | Marishige | EG-400 | ||
| Micro Forge | Marishige | MF-830 | ||
| Manual Microsyringe Pump | WPI | MMP | ||
| Forceps | Fine Science Tools | 11232-20 | ||
| Hydrofluoric Acid | Fisher Scientific | A147-1 | ||
| Penicillin- Streptomycin | GIBCO | 15140-122 | ||
| Agarose | RPI (Research Products International Corp.) | 9012-36-6 | ||
| Low melting agarose | Fisher Scientific | BP165-25 |
E3 egg water:
- 5 mM NaCl
- 0.17 mM KCl
- 0.33 mM CaCl2
- 0.33 mM MgSO4
- 0.1% methylene blue
References
- Zou, J., Lathrop, K., Sun, M., Wei, X. Intact RPE maintained by Nok is essential for retinal epithelial polarity and cellular patterning in zebrafish. Journal of Neuroscience. 28 (50), 13684-13695 (2008).
- Westerfield, M. A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). THE ZEBRAFISH BOOK. , (2007).
- Ho, R. K., Kane, D. A. Cell-autonomous action of zebrafish spt-1 mutation in specific mesodermal precursors. Nature. 348, 728-730 (1990).
- Catalano, A., Raymond, P., Goldman, D., Wei, X. Zebrafish dou yan Mutation Causes Patterning Defects and Extensive Cell Death in the Retina. Developmental Dynamics. 236 (5), 1295-1236 (2007).
