의 이식 GFP - 표현 키메라 Zebrafish의 태아의 망막과 두뇌 개발의 라이브 영상에 대한 Blastomeres을
Summary
우리는 embryogenesis 동안 라이브 이미징 세포 행동 키메라 zebrafish의 배아를 생성하는 프로토콜을 보여줍니다.
Abstract
세포 embryogenesis 동안 자신의 위치와 속성에 광범위하게 변경합니다. 이러한 변경은 세포와 그 환경 사이의 상호 작용에 의해 규제됩니다. 다른 유전 배경의 세포 구성되어 있으며 키메라 배아는 관심의 유전자에 의해 중재 세포 세포 상호 작용을 연구하는 훌륭한 도구입니다. 초기 발달 단계에 zebrafish의 배아 투명성은 세포 수준에서 조직과 장기의 morphogenesis 직접 시각화 수 있습니다. 여기, 우리는 zebrafish 배아의 망막과 두뇌 키메라를 생성하고 기증자의 세포의 라이브 영상을 수행하는 프로토콜을 보여줍니다. 프로토콜은 이식의 바늘의 이식의 준비를 다루고 GFP – 표현 GFP – 부정적인 호스트 기증자 blastomeres를 라이브 공촛점 현미경 하에서 공여 세포 행동의 시험. 약간의 수정과 함께,이 프로토콜은 또한 zebrafish에서 다른 조직과 장기의 배아 발달을 연구하는 데 사용할 수 있습니다. 레이블 기증자 세포에 GFP를 사용하는 장점도 설명합니다.
Protocol
Discussion
이 비디오에서는, 우리는 zebrafish의 망막과 두뇌 개발을 분석 blastomere 이식하는 방법을 보여줍니다. 이 프로토콜은 또한 단순히 호스트 배아의 해당 위치로 기증자 blastomeres을 출시하여 다른 조직과 기관의 발전을 분석하는 데 사용할 수 있습니다. GFP 분자와 라벨링은 형광 염료 복합 Dextran (호 케인 1990)와 라벨보다 깔끔한 배경을 산출. 죽은 기증자 세포에서 Dextran의 염료의 잔해가 있으므로 영상 …
Acknowledgements
NIH 그랜트 R01EY016099 및 실명 경력 개발 상을 방지하기 위해 연구 : 본 연구는 건강의 국립 연구소 (NIH) 코어 그랜트 (5P30EY008098) 다음과 같은 자금 XW에 의해 지원되었다. 우리는 공촛점 이미징에 도움 키라 라스럽 감사합니다.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| 5 ¾” Glass pipette | Fisher Scientific | 13-678-30 | ||
| Borosilicate Glass Capillary | WPI (World Precision Instruments, Inc.) | 1B100F-4 | ||
| FluoroDish | WPI | FD35 | ||
| Vertical Needle / pipette Puller | David Kopf Instruments | Model 720 | ||
| Micro Grinder | Marishige | EG-400 | ||
| Micro Forge | Marishige | MF-830 | ||
| Manual Microsyringe Pump | WPI | MMP | ||
| Forceps | Fine Science Tools | 11232-20 | ||
| Hydrofluoric Acid | Fisher Scientific | A147-1 | ||
| Penicillin- Streptomycin | GIBCO | 15140-122 | ||
| Agarose | RPI (Research Products International Corp.) | 9012-36-6 | ||
| Low melting agarose | Fisher Scientific | BP165-25 |
E3 egg water:
- 5 mM NaCl
- 0.17 mM KCl
- 0.33 mM CaCl2
- 0.33 mM MgSO4
- 0.1% methylene blue
References
- Zou, J., Lathrop, K., Sun, M., Wei, X. Intact RPE maintained by Nok is essential for retinal epithelial polarity and cellular patterning in zebrafish. Journal of Neuroscience. 28 (50), 13684-13695 (2008).
- Westerfield, M. A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). THE ZEBRAFISH BOOK. , (2007).
- Ho, R. K., Kane, D. A. Cell-autonomous action of zebrafish spt-1 mutation in specific mesodermal precursors. Nature. 348, 728-730 (1990).
- Catalano, A., Raymond, P., Goldman, D., Wei, X. Zebrafish dou yan Mutation Causes Patterning Defects and Extensive Cell Death in the Retina. Developmental Dynamics. 236 (5), 1295-1236 (2007).
