Live-cell imaging en kwantitatieve analyse van de embryonale epitheelcellen in Xenopus laevis</em
Summary
Xenopus embryonale epitheel is een ideaal modelsysteem om cel gedrag, zoals polariteit ontwikkeling en vorm veranderen tijdens epitheliale morfogenese bestuderen. Traditionele histologie van vaste monsters wordt in toenemende mate aangevuld door live-cell imaging confocale. Hier laten we zien methoden om de kikker weefsel te isoleren en te visualiseren live-epitheliale cellen en hun cytoskelet met behulp van live-cell confocale microscopie.
Abstract
Embryonale epitheliale cellen dienen als een ideaal model om de morfogenese bestuderen waar multi-cellulaire weefsels ondergaan veranderingen in hun geometrie, zoals veranderingen in de cel-cel-oppervlakte en hoogte, en waar cellen ondergaan mitose en migreren. Bovendien kan epitheliale cellen ook reguleren morfogenetische bewegingen in de aangrenzende weefsels<sup> 1</sup>. Een traditionele methode om epitheliale cellen en weefsels te bestuderen betrekken chemische fixatie en histologische methoden om celmorfologie of lokalisatie van bepaalde eiwitten van belang vast te stellen. Deze benaderingen nog steeds nuttig en "snapshots" van de cel vormen en weefsels architectuur te bieden, echter, er nog veel worden begrepen over hoe cellen te verkrijgen specifieke vormen, hoe de verschillende eiwitten te verplaatsen of te lokaliseren op specifieke posities, en welke paden cellen te volgen in de richting van hun laatste gedifferentieerde lot. Hoge resolutie live-imaging aanvulling op de traditionele methoden en maakt het ook mogelijk meer direct onderzoek naar de dynamische cellulaire processen betrokken bij de vorming, het onderhoud en morfogenese van meercellige epitheliale vellen. Hier laten we zien experimentele methodes uit het isolement van dierlijk cap weefsels van<em> Xenopus laevis</em> Embryo's met confocale beeldvorming van epitheliale cellen en eenvoudige meting benaderingen die elkaar kunnen aanvullen moleculaire en cellulaire studies van epitheliale morfogenese.
Protocol
Discussion
We hebben gepresenteerd experimentele protocollen regelmatig gebruikt in ons lab om de afbeelding dynamisch veranderende cytoskelet in de apicale cel cortex en oscillerende celmembranen van epitheelcellen in Xenopus embryo's. Men moet gebruiken deze protocollen als uitgangspunt voor live-imaging van epitheliale cellen vormen, optimalisatie van dit protocol is essentieel en een deel van de instellingen veranderen, afhankelijk van het type microscoop systeem een heeft en de aard van de eiwitten die men …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd ondersteund door een National Institutes of Health (R01-HD044750), een carrière subsidie van de National Science Foundation, en ondersteuning van de American Heart Association (Begin Grant-in-Aid). De auteurs danken Davidson Lab leden: HY Kim, M. von Dassow en J. Zhou (voor hulp met dagelijkse verantwoordelijkheden lab), en Lin Zhang voor haar hulp in de moleculaire biologie en synthetiseren van mRNA. Wij erkennen experimentele inspanningen van alle de kikker labo's (met name Ray Keller en Doug DeSimone's), die hebben bijgedragen aan een deel van dit protocol, door het ontwikkelen en testen van verschillende methoden door de jaren heen. Wij danken Richard Harland en John Wallingford voor hun vriendelijke gaven van mem-GFP en Moesin-GFP plasmiden respectievelijk.
References
- Ninomiya, H., Winklbauer, R. Epithelial coating controls mesenchymal shape change through tissue-positioning effects and reduction of surface-minimizing tension. Nat Cell Biol. 10 (1), 61-61 (2008).
- Kay, B. K., Peng, H. B. . Xenopus laevis: Practical Uses in Cell and Molecular Biology. , (1991).
- Cross, M. K., Powers, M. Obtaining eggs from Xenopus laevis females. J Vis Exp. , (2008).
- Cohen, S., Au, S., Pante, N. Microinjection of Xenopus laevis oocytes. J Vis Exp. , (2009).
- Nieuwkoop, P. D., Faber, J. . Normal Tables of Xenopus laevis (Daudin). , (1967).
- Davidson, L. A., Ezin, A. M., Keller, R. Embryonic wound healing by apical contraction and ingression in Xenopus laevis. Cell Motil Cytoskeleton. 53 (3), 163-163 (2002).
- Joshi, S. D., Dassow, M. v. o. n., Davidson, L. A. Experimental control of excitable embryonic tissues: three stimuli induce rapid epithelial contraction. Exp Cell Res. 316 (1), 103-103 (2010).
