Nous décrivons une molécule à base de petites protocole pour la différenciation des cellules souches embryonnaires de souris en cellules précurseurs des oligodendrocytes (OPC). Ce protocole génère Olig2 + NG2 + OPC avec un rendement élevé de 30 jours de différenciation. Nous décrivons également une méthode pour générer des "dopage" OPC qui peut tirer des potentiels d'action.
Les oligodendrocytes sont les cellules myélinisantes du système nerveux central. Pour la thérapie cellulaire régénérative dans les maladies démyélinisantes, il ya un intérêt significatif en dérivant une population pure de la lignée de cellules précurseurs commis-oligodendrocytes (OPC) pour la transplantation. Les OPC sont caractérisées par l'activité du facteur de transcription Olig2 et d'expression de surface d'un NG2 protéoglycanes. Utilisation de la GFP-Olig2 (G-Olig2) de cellules souches embryonnaires de souris (MESC) ligne journaliste, nous avons optimisé les conditions de la différenciation des mESCs en GFP + + Olig2 NG2 + OPC. Dans notre protocole, nous décrivons d'abord la génération des corps embryoïdes (EB) à partir mESCs. Deuxièmement, nous décrivons le traitement des MESC dérivés EBS avec de petites molécules: (1) l'acide rétinoïque (AR) et (2) purmorphamine un hérisson Sonic agoniste (Shh) (Pur), dans des conditions de culture définie pour diriger une différenciation EB dans la lignée oligodendrocyte. Par cette approche, les OPC peuvent être obtenus avec un rendement élevé (> 80%) dans un délai de 30 jours. Les cellules dérivées de mESCs dans ce protocole sont phénotypiquement similaire à OPCs issus de culture de tissus primaires. L'OPC MESC dérivés ne montrent pas la propriété de dopage décrites pour une sous-population des OPC du cerveau in situ. Pour étudier cette propriété électrophysiologique, nous décrivons la génération de dopage MESC dérivé OPC par ectopique exprimer Na<sub> V</sub> 1,2 sous-unité. Les cellules de fortification et nonspiking obtenus à partir de ce protocole aidera les études fonctionnelles d'avance sur les deux sous-populations d'OPC.
Les cellules souches embryonnaires (CSE), isolé à partir d'un embryon de blastocyste, peuvent se différencier en tous les lignées cellulaires de l'organisme 3, 4, fournissant un système modèle in vitro pour étudier le développement précoce des mammifères, y compris la spécification des oligodendrocytes. mESCs a été démontré que de se différencier en cellules précurseurs des oligodendrocytes (OPC) avec le traitement de Sonic Hedgehog (Shh) 5. Par ailleurs, la différenciation induite par Shh OPC de mESCs conserve la synchronisation correcte observés dans le développement embryonnaire 6. Ainsi, la nature du diagnostic in vitro OPC différenciation par mESCs est considéré comme compatible avec ce qui a été appris de développement in vivo. Ici, en utilisant les petites molécules et la RA Pur agoniste Shh, nous avons réussi à différencier l'mESCs G-Olig2 en GFP + + Olig2 NG2 + OPC avec une grande efficacité.
OPC, caractérisé par l'expression du protéoglycane NG2 7 et le facteur de transcription hélice-boucle-hélice Olig2 8, générer des oligodendrocytes dans le SNC en développement et matures, où ils représentent une proportion importante (~ 5%) du nombre total de cellules et sont les principaux types de cellules proliférantes 9. Pour les chercheurs de près de deux décennies ont démontré Na canaux V sont exprimés dans une sous-population d'OPC et peut être activé à la dépolarisation 10, 11. Par ailleurs, une récente observation frappante est que, dans neuf dans le système nerveux central chez le rat in situ de la matière blanche, les OPC (~ 50%) ont généré des potentiels d'action lors dépolarisée selon l'expression de voltage-dépendants de sodium (Na V) des canaux, et pourrait donc être subdivisé en de dopage et nonspiking sous-populations. Cependant, les fonctions de ces propriétés de dopage sont encore largement inconnus. Nous avons constaté que, électrophysiologique, l'OPC MESC dérivés différenciés avec le protocole Shh-dépendants, ne sont pas les mêmes que l'OPC dans le cerveau in situ. Après l'introduction de la sous-unité Na V 1.2, ces silencieux MESC dérivé OPC étaient capables de dopage.
Ainsi, le dopage / nonspiking MESC dérivé OPC et le protocole de différenciation décrites ici peuvent faciliter (1) étudier les différences fonctionnelles entre dopage et nonspiking OPC, (2) les facteurs de dépistage de nouvelles qui pourraient favoriser l'expression des canaux sodiques dans les OPCs MESC dérivés, ( 3) le développement et l'optimisation du protocole de différenciation des OPC de CSE humaines ou des cellules souches pluripotentes induites (CISP).
The authors have nothing to disclose.
Ce travail a été en partie soutenu par des subventions à partir de DEO National Institutes of Health (RO1 NS059043 et RO1 ES015988), National Multiple Sclerosis Society, Roche Foundation for recherche de l'anémie, Feldstein Fondation médicale, et les Hôpitaux Shriners pour enfants.
Nous tenons à remercier le Dr David Plaisir et Jennifer Avion pour des suggestions. Nous déclarons sans intérêts concurrents liés à cet article.
Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
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MEFs | GlobalStem | GSC-6001G | ||
TrypLE Express | Invitrogen | 12604 | ||
Retinoic acid | Sigma | R-2625 | ||
Purmorphamine | Cayman Chemical | 10009634 | ||
FGF-2 | Millipore | GF003 | ||
BacMam NaV 1.2 | Invitrogen | B10341 |