Summary
אנו מתארים בסיס מולקולות קטנות פרוטוקול התמיינות תאים העכבר גזע עובריים לתאי מבשר oligodendrocyte (OPCs). פרוטוקול זה יוצר Olig2 NG2 + + OPCs עם יעילות גבוהה של 30 ימים של בידול. כמו כן, אנו מתארים שיטה להפקת "מתחזקים" בצורה OPCs שיכולים אש הפוטנציאלים לפעולה.
Abstract
Oligodendrocytes הם תאים myelinating של מערכת העצבים המרכזית. עבור טיפול בתא משובי במחלות demyelinating, יש עניין משמעותי הנובע אוכלוסייה טהורה של השושלת, מחויב תאים מבשר oligodendrocyte (OPCs) להשתלה. OPCs מאופיינות בפעילות של Olig2 גורם שעתוק וביטוי פני השטח של NG2 proteoglycan. בעזרת ה-GFP-Olig2 (G-Olig2) עכבר תא גזע עובריים (המסקלין) קו עיתונאי, אנו אופטימיזציה התנאים בידול של mESCs לתוך ה-GFP Olig2 + + + NG2 OPCs. בפרוטוקול שלנו, אנחנו הראשונים לתאר את הדור של גופים embryoid (EBS) מ mESCs. שנית, אנו מתארים את הטיפול המסקלין הנגזרות EBS עם מולקולות קטנות: (1) חומצה רטינואית (RA) ו - (2) קיפוד קולי (ששש) purmorphamine אגוניסט (פור) בתנאים מוגדרים תרבות לכוון בידול EB לתוך השושלת oligodendroglial. לפי גישה זו, OPCs ניתן להשיג עם יעילות גבוהה (> 80%) בפרק זמן של 30 ימים. תאים שמקורם mESCs בפרוטוקול זה דומים phenotypically כדי OPCs שמקורם בתרבית רקמה ראשונית. המסקלין הנגזרות OPCs לא להראות את הנכס spiking תיאר subpopulation של OPCs המוח באתרם. כדי לחקור את הנכס הזה אלקטרו, אנו מתארים את הדור של spiking המסקלין הנגזרות OPCs ידי ectopically להביע Na
Protocol
נהלים מפורטים של יצירת תאים מבשר oligodendrocyte (OPCs) מ-GFP Olig2 בתאי גזע עובריים בעכבר (mESCs):
- עכבר קו ES תא GFP-Olig2 (G-Olig2), הוא רכש מן האוסף התרבות האמריקאית סוג (ATCC). MESCs הם passaged שגרתי כל 3 ימים על העכבר מוקרן עובריים שכבת פיברובלסטים מזין (MEF). התאים הם MEF מצופה לתוך הג'לטין 0.1% מצופי שש היטב בתרבות רקמה צלחת לפחות יום אחד לפני passaging ESCs. בינוני תרבות המסקלין הוא מדיום שונה Dulbecco של הנשר (DMEM) (GIBCO) בתוספת 20% עוברי שור בסרום (GIBCO), 2 מ"מ L-גלוטמין, 1 נתרן pyruvate מ"מ, 0.1 β-mercaptoethanol /, mM חומצות 1% אמינו חיוניות ( NEAA), ו - 1000 U / ml מעכבות גורם ללוקמיה.
- מושבות MES הם trypsinized (TrypLE, 5 דקות, 37 ° C) לתאים בודדים המרחפים בנוקאאוט בסרום בינוני (KSR) תחליף, אז התאים מועברים מצורף שחקן המשנה Ultra-Low שש היטב צלחת (קורנינג) בכל תא צפיפות של 50,000 תאים / 2 ס"מ. בתנאים אלה, mESCs טופס גופים embryoid (EBS). KSR בינוני מורכב, בינוני מינימלי חיוני (-ממ) בתוספת KSR 20%, 1 נתרן pyruvate מ"מ, NEAA 1%, ו - 0.1 mM β-mercaptoethanol /.
- מאותו יום 4 יום 7, חומצה רטינואית (RA, 0.2 מ ') ו purmorphamine (פור, 1 מ') כלולים כפי שמוצג באיור. 1A ב KSR N2 או בינוני. המדיום הוא N2-ממ המכיל תוספת 1X N2, נתרן 1 mM pyruvate, NEAA 1%, ו - 0.1 mM β-mercaptoethanol /. המדיום משתנה כל יום.
- באותו יום 8, EBS הם disaggregated באמצעות TrypLE (5min, 37 ° C) מצופה על polyornithine מצופה מנות 0.01% במדיום OPC שמורכבת בינוני N2 ו פיברובלסטים גורם הגדילה-2 (FGF-2, 20 ng / ml). המדיום משתנה כל יומיים.
- התאים trypsinized (TrypLE, 3 דקות, 37 ° C) replated בערך כל שבוע כאשר הם הופכים ומחוברות. באותו יום 30, מעל 80% מהתאים מראים GFP/Olig2 הביטוי הם NG2 חיובי, האופיינית OPCs.
- כדי ליצור OPCs spiking, Na + BacMam ערוץ ערכת משמש להציג Na v 1.2 למקטע לתוך אלה המסקלין הנגזרות OPCs. מגיב BacMam (1, מרכיב מ"ל) מעורבב עם PBS לנפח סופי של 5 מ"ל. לאחר מכן, מגיב BacMam מעורבת מתווסף לתוך התרבות OPCs המסקלין הנגזרות בצלחת תרבות 60 מ"מ (בנקודת המפגש 50-70%) לפני השטיפה עם PBS. לאחר דגירה 2 שעות, מגיב BacMam מעורבת מוסר והוחלפו בינוני OPC בתוספת משפר 1X. משפר הוא B מרכיב מחדש ב DMSO (רכיב C). בשלב הבא, לאחר דגירה של 2 שעות נוספות עם המדיום משפר מוסר והוחלפו בינוני OPC להשלים. התאים assayed 24 שעות מאוחר יותר.
נציג תוצאות:
בעקבות פרוטוקול בידול באיור. 1A, G-Olig2 mESCs הושעו תחילה בינוני KSR ובמשך 4 ימים כדי ליצור גופים embryoid (EBS) (איור 1B). לאחר מכן, אנו ברצף התייחסו EBS עם RA ו - פור. EBS לא הראה שום הקרינה ב-GFP יום 4 והביע הקרינה GFP חזק D8 (איור 1B). בנקודה זו בזמן, EBS היו trypsinized ו מצופה במדיום N2 בתוספת גורמי גדילה FGF-2. אחרי תרבות נוספת במשך 22 ימים (D30), אחוז תאים + GFP הגיעו 80.3 ± 0.6% על פי cytometry זרימת התוצאות שלנו. כפי שמוצג באיור. 1C, GFP + תאים חפפו עם מכתים NG2 בעקביות (96.4 ± 1.3% של תאים GFP חיובית היו NG2 חיובית, 94.8 ± 1.5% NG2 תאים חיובי GFP היו חיוביים). לכן, תאים אלה מבטאים GFP/Olig2 ו NG2, הגדרת אותם OPCs.
המסקלין הנגזרות OPCs (76 תאים), לא הצליחו לירות פוטנציאל פעולה על שלילת קוטביות (איור 2 א). לאחר transducing עם baculovirus נושאת את Na v 1.2 למקטע, המסקלין הנגזרות הללו OPCs (94.1%, 16 מתוך 17 תאים) יכולה להיות מסווגת spiking (איור 2B).
באיור 1. דיפרנציאציה של GOlig-המסקלין לתוך OPCs. (א) תוכנית המציגה את הפרוטוקול של הגוף embryoid (EB) מבוססי מולקולה קטנה מונחה בידול. בשעה D8, EBS היו disaggregated ו מצופה. התאים היו passaged פעם בשבוע כאשר הם הפכו ומחוברות. (ב) D8, אך לא D4 EBS, הראתה ביטוי של GFP. (ג) Immunostaining של NG2 (אדום) עולה בקנה אחד עם ה-GFP (ירוק) ביטוי ב D30. DAPI (כחול) היה בשימוש כדי לזהות את הגרעינים. בר קנה מידה: 20 מ"מ.
איור 2. דור OPCs spiking מ nonspiking המסקלין הנגזרות OPCs ידי וירוס בתיווך Na v ביטוי הערוץ. (א) פוטנציאל הממברנה נערך -60 mV ו המסקלין הנגזרות OPCs נכשל אש הפוטנציאלים לפעולה, גם כאשר התא היה depolarized ל 0 mV. (ב) דוגמה המסקלין הנגזרות OPCיורים פוטנציאל פעולה (מסומן באדום) לאחר התמרה ויראלית.
Discussion
לתאי גזע עובריים (ESCs), שבודד עובר הבלסטוציסט, יכולים להתמיין לכל שושלות תאים של האורגניזם 3, 4, מתן במערכת מודל במבחנה לחקר יונקים התפתחות מוקדם, כולל מפרט oligodendrocyte. mESCs הוכחו להתמיין לתאי מבשר oligodendrocyte (OPCs) עם טיפול של קיפוד קולי (ששש) 5. יתר על כן, בידול ששש-Induced OPC מ mESCs שומרת לעצמה את העיתוי הנכון שנצפתה ההתפתחות העוברית 6. לפיכך, אופי של בידול OPC במבחנה מן mESCs נחשב בקנה אחד עם מה שנלמד מן בפיתוח vivo. הנה, באמצעות מולקולות קטנות RA ואת פור אגוניסט ששש, אנחנו הבדיל בהצלחה את ה-G-Olig2 mESCs לתוך ה-GFP Olig2 + + + NG2 OPCs עם יעילות גבוהה.
OPCs, המאופיינת הביטוי של proteoglycan NG2 7 ו הגורם הסליל לולאה, סליל שעתוק Olig2 8, ליצור oligodendrocytes ב CNS בפיתוח בוגרת, שם הם מהווים אחוז משמעותי (~ 5%) של תאים הכולל הן סוג התא העיקרי מתרבים 9. במשך כמעט שני עשורים חוקרים הוכיחו Na ערוצי V באים לידי ביטוי subpopulation של OPCs והוא יכול להיות מופעל על שלילת קוטביות 10, 11. יתר על כן, תצפית מרשימה האחרונות 9 היה כי ב CNS עכברוש באתרו החומר הלבן, OPCs (~ 50%) שנוצר פוטנציאל פעולה כאשר depolarized בהתאם הביטוי של נתרן מתח מגודרת (Na V) ערוצים, ולכן יכול להיות מחולק spiking ו nonspiking subpopulations. עם זאת, את הפונקציות של מאפיינים אלה spiking עדיין אינו ידוע ברובו. מצאנו כי, electrophysiologically, המסקלין הנגזרות OPCs הבדיל עם פרוטוקול ששש תלויים, לא היה זהה ב OPCs המוח באתרה. לאחר החדרת למקטע Na V 1.2, אלה שקט המסקלין הנגזרות OPCs היו מסוגלים spiking.
לפיכך, spiking / nonspiking המסקלין הנגזרות OPCs ופרוטוקול בידול המתוארת כאן עשויה להקל (1) ללמוד את ההבדלים בין תפקודי spiking ו nonspiking OPCs, (2) גורמים ההקרנה חדש שיכול לקדם ערוץ ביטוי נתרן המסקלין הנגזרות OPCs, ( 3) פיתוח ואופטימיזציה של פרוטוקול בידול של OPCs מן האדם ESC או גזע המושרה pluripotent תאים (iPSCs).
Disclosures
אין ניגודי אינטרסים הכריז.
Acknowledgments
עבודה זו הייתה חלק נתמך על ידי מענקים ל WD מן המכונים הלאומיים לבריאות (RO1 NS059043 ו RO1 ES015988), טרשת נפוצה האגודה הלאומית, רוש קרן מחקר אנמיה, פלדשטיין רפואי הקרן, ואת שריינרים חולים לילדים.
ברצוננו להודות לד"ר תענוג דוד מטוס ג'ניפר לקבלת הצעות. אנו מצהירים שום אינטרסים מתחרים הקשורים במאמר זה.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MEFs | GlobalStem | GSC-6001G | |
| TrypLE Express | Invitrogen | 12604 | |
| Retinoic acid | Sigma-Aldrich | R-2625 | |
| Purmorphamine | Cayman Chemical | 10009634 | |
| FGF-2 | EMD Millipore | GF003 | |
| BacMam NaV 1.2 | Invitrogen | B10341 |
References
- Xian, H., Gottlieb, D. I. Dividing Olig2-expressing progenitor cells derived from ES cells. Glia. 47 (1), 88-101 (2004).
- Clair, A., Gottlieb, D. I. A subset of ES-cell-derived neural cells marked by gene targeting. Stem Cells. 21 (1), 41-49 (2003).
- Evans, M. J., Kaufman, M. H. Establishment in culture of pluripotential cells from mouse embryos. Nature. 292, 154-156 (1981).
- Thomson, J. A. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 282, 1145-1147 (1998).
- Shin, S., Xue, H., Mattson, M. P., Rao, M. S. Stage-dependent Olig2 expression in motor neurons and oligodendrocytes differentiated from embryonic stem cells. Stem Cells Dev. 16, 131-141 (2007).
- Billon, N., Jolicoeur, C., Ying, Q. L., Smith, A., Raff, M. Normal timing of oligodendrocyte development from genetically engineered, lineage-selectable mouse ES cells. J Cell Sci. 115, 3657-3665 (2002).
- Nishiyama, A., Lin, X. H., Giese, N., Heldin, C. H., Stallcup, W. B. Co-localization of NG2 proteoglycan and PDGF alpha-receptor on O2A progenitor cells in the developing rat brain. J Neurosci Res. 43, 299-314 (1996).
- Ligon, K. L. Development of NG2 neural progenitor cells requires Olig gene function. Proc Natl Acad Sci U S A. 103, 7853-7858 (2006).
- Dawson, M. R., Polito, A., Levine, J. M., Reynolds, R. NG2-expressing glial progenitor cells: an abundant and widespread population of cycling cells in the adult rat CNS. Mol Cell Neurosci. 24, 476-488 (2003).
- Chittajallu, R., Aguirre, A., Gallo, V. NG2-positive cells in the mouse white and grey matter display distinct physiological properties. J Physiol. 561, 109-122 (2004).
- Karadottir, R., Hamilton, N. B., Bakiri, Y., Attwell, D. Spiking and nonspiking classes of oligodendrocyte precursor glia in CNS white matter. Nat Neurosci. 11, 450-456 (2008).
