Se describe una molécula basada en pequeñas protocolo para la diferenciación de las células madre embrionarias de ratón en células precursoras de oligodendrocitos (OPC). Este protocolo genera Olig2 + NG2 + OPC con alta eficiencia de 30 días de diferenciación. También describe un método para generar "picos" OPC que puede disparar potenciales de acción.
Los oligodendrocitos son las células myelinating del sistema nervioso central. Para la terapia celular regenerativa en enfermedades desmielinizantes, existe un interés significativo en la obtención de una población pura de linaje comprometido precursores de oligodendrocitos (OPC) para el trasplante. OPC se caracterizan por la actividad de la Olig2 factor de transcripción y expresión en la superficie de un proteoglicano NG2. Uso de la GFP-Olig2 (G-Olig2) de ratón con células madre embrionarias (MESC) línea de reportero, que optimiza las condiciones para la diferenciación de las buenas prácticas agrarias en mESCs + + Olig2 NG2 + OPC. En nuestro protocolo, lo primero que describe la generación de cuerpos embrioides (EBS) de mESCs. En segundo lugar, se describe el tratamiento de la MESC derivados de EBS con pequeñas moléculas: (1) el ácido retinoico (RA) y (2) un erizo sónico (Shh) purmorphamine agonista (Pur) bajo condiciones de cultivo definido para dirigir la diferenciación EB en el linaje oligodendroglial. Con este enfoque, los OPC se puede obtener con una alta eficiencia (> 80%) en un plazo de 30 días. Las células derivadas de mESCs en este protocolo son fenotípicamente similares a los OPC derivadas del cultivo de tejidos primarios. El OPC MESC derivados no muestran la propiedad de adición se describe de una subpoblación de OPC cerebro in situ. Para el estudio de esta propiedad electrofisiológicos, se describe la generación de picos MESC derivados de OPC por ectópica expresando Na<sub> V</sub> 1.2 subunidad. Las células enriquecidas y nonspiking obtenidos a partir de este protocolo ayudará a avanzar los estudios funcionales en las dos subpoblaciones de OPC.
Las células madre embrionarias (CME), aisladas de un embrión blastocisto, pueden diferenciarse en todos los linajes de las células del organismo 3, 4, proporcionando un sistema en el modelo in vitro para el estudio de desarrollo de los mamíferos tempranos, incluyendo la especificación de oligodendrocitos. mESCs se ha demostrado que se diferencian en células precursoras de oligodendrocitos (OPC) con el tratamiento de sonic hedgehog (Shh) 5. Por otra parte, la diferenciación inducida por Shh OPC de mESCs mantiene la sincronización correcta observado en el desarrollo embrionario 6. Por lo tanto, la naturaleza de la diferenciación in vitro de OPC mESCs se considera que es consistente con lo que se ha aprendido en el desarrollo in vivo. En este caso, utilizando el pequeño RA moléculas y el Pur agonista Shh, hemos podido diferenciar el mESCs G-Olig2 en GFP + + Olig2 NG2 + OPC con alta eficiencia.
OPC, que se caracteriza por la expresión de los proteoglicanos NG2 7 y el factor de transcripción hélice-lazo-hélice Olig2 8, generar oligodendrocitos en el SNC en desarrollo y madurez, donde representan un porcentaje importante (~ 5%) del total de células y son las principal tipo de células proliferantes 9. Durante casi dos décadas los investigadores han demostrado los canales de Na V se expresan en una subpoblación de los OPC y se puede activar a la despolarización de 10, 11. Por otra parte, una reciente observación sorprendente fue que en nueve en el SNC de rata in situ la materia blanca, los OPC (~ 50%) generaron los potenciales de acción cuando se despolariza dependiendo de la expresión del voltaje de sodio (Na V) canales, y por lo tanto podría subdividirse en remate y nonspiking subpoblaciones. Sin embargo, las funciones de estas propiedades de picos aún no se conocen. Hemos encontrado que, electrofisiológica, la OPC MESC derivados diferenciados con el protocolo de Shh-dependiente, no eran las mismas que las OPC en el cerebro in situ. Después de la introducción de la subunidad Na V 1.2, estos silenciosos MESC derivados de los OPC eran capaces de clavar.
Por lo tanto, la adición / nonspiking MESC derivados de los OPC y protocolo de diferenciación descrito aquí puede facilitar (1) el estudio de las diferencias funcionales entre los picos y nonspiking OPC, (2) los factores de selección nueva que podría promover la expresión de los canales de sodio en el OPC MESC derivados, ( 3) el desarrollo y la optimización del protocolo de diferenciación de los OPC de la ESC humanos o células madre pluripotentes inducidas (CMPi).
The authors have nothing to disclose.
Este trabajo fue apoyado en parte por subvenciones de WD de los Institutos Nacionales de Salud (SR1 NS059043 y ES015988 SR1), la Sociedad Nacional de Esclerosis Múltiple, Fundación Roche para la Investigación de la Anemia, Feldstein Medical Foundation, y los Hospitales Shriners para niños.
Nos gustaría agradecer al Dr. David Placer y el plano de Jennifer sugerencias. Declaramos que no hay intereses contrapuestos en relación con este artículo.
Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
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MEFs | GlobalStem | GSC-6001G | ||
TrypLE Express | Invitrogen | 12604 | ||
Retinoic acid | Sigma | R-2625 | ||
Purmorphamine | Cayman Chemical | 10009634 | ||
FGF-2 | Millipore | GF003 | ||
BacMam NaV 1.2 | Invitrogen | B10341 |