Rotulagem e Células de imagem no rombencéfalo Zebrafish
Summary
Chave para a compreensão dos processos morfogenéticos que forma o embrião precoce é a capacidade de células de imagem em alta resolução. Descrevemos aqui uma técnica para a rotulagem células isoladas ou pequenos aglomerados de células em embriões de peixe-zebra inteira com membrana-alvo Proteína Fluorescente Verde.
Abstract
Chave para a compreensão dos processos morfogenéticos que forma o embrião de vertebrados precoce é a capacidade de células de imagem em alta resolução. Em embriões de peixe-zebra, a injeção de DNA plasmídeo resultados na expressão de mosaico, permitindo a visualização de células isoladas ou pequenos aglomerados de células<sup> 1</sup>. Descrevemos como injeção de codificação de DNA plasmídeo membrana-alvo Proteína Fluorescente Verde (mGFP) sob o controle de um promotor onipresente pode ser usado para as células de imagem passando neurulação. Central a este protocolo é a metodologia para as células de imagens rotuladas em alta resolução em seções e também em tempo real. Este protocolo envolve a injeção de DNA em embriões de peixe-zebra mGFP jovens. Embriões são então processadas para o seccionamento vibratome, rotulagem de anticorpos e de imagem com um microscópio confocal. Alternativamente, embriões vivos expressando mGFP pode ser fotografada usando lapso de tempo de microscopia confocal. Nós já usou esta abordagem simples para analisar os comportamentos celulares que levam a formação do tubo neural na região rombencéfalo de embriões zebrafish<sup> 2</sup>. Os preparativos fixo permitido para visualização sem precedentes de formas e organização das células no tubo neural, enquanto imagens ao vivo complementada esta abordagem, possibilitando uma melhor compreensão da dinâmica celular que ocorrem durante a neurulação.
Protocol
Discussion
Em conclusão, as técnicas descritas aqui rotulagem permitem uma análise única célula de processos morfogenéticos no embrião do zebrafish. A ênfase principal deste protocolo é sobre os métodos de células imagem rotulada no tubo neural usando mGFP sob o controle de um promotor onipresente. Para aplicações adicionais leitores deste ensaio transiente expressão deve se referir a um artigo recente de Andersen et al. 3.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi financiado por uma bolsa NIH concedido a R. Brewster (1R01GM085290-01A1).
Materials
Solutions
- Hank’s Stock #1: 8.0 g NaCl , 0.4 g KCl in 100 ml dd H2O
- Hank’s Stock #2: 0.358 g Na2HPO4 Anhydrous, 0.60 g KH2PO4 in 100 ml ddH2O
- Hank’s Stock #4: 0.72 g CaCl2 in 50 ml ddH2O
- Hank’s Stock #5: 1.23 g MgSO4x7H2O in 50 ml dd H2O
- 1 X Phosphate Buffer: 0.8% NaCl, 0.02% KCl, 0.02 M PO4, pH 7.3
- Blocking Solution: 2% normal goat serum, 1% bovine serum albumin (BSA), 1% dimethysulfoxide (DMSO)
References
- Nüsslein-Volhard, C., Dahm, R. . Zebrafish Practical approach series. , (2002).
- Hong, E., Brewster, R. N-cadherin is required for the polarized cell behaviors that drive neurulation in the zebrafish. Development. 133, 3895-3905 (2006).
- Andersen, E., Asuri, N., Clay, M., Halloran, M. Live Imaging of Cell Motility and Actin Cytoskeleton of Individual Neurons and Neural Crest Cells in Zebrafish Embryos. J Vis Exp. , (2010).
