إعداد ذبابة الفاكهة خلايا S2 الميكروسكوب لايت
Summary
ذبابة الفاكهة شنايدر (S2) الخلايا نظام شعبية متزايدة لاكتشاف وتحليل وظيفي من الجينات. هدفنا هو وصف بعض التقنيات التي تجعل الخلايا المجهرية S2 مثل هذا النظام أهمية متزايدة التجريبية.
Abstract
فإن النظام المثالي التجريبية تكون رخيصة وسهلة للحفاظ على ، قابلة لمجموعة متنوعة من التقنيات ، وسوف تكون معتمدة من قبل دراسات واسعة النطاق وقاعدة بيانات الجينوم التسلسل. مثقف خلايا ذبابة الفاكهة S2 ، نتاج نأت الأجنة 20-24 ساعة قديمة 1 ، تمتلك كل هذه الخصائص. وبالتالي ، فإن خلايا S2 هي غاية مناسبة تماما لتحليل العمليات الخلوية ، بما في ذلك اكتشاف الجينات ترميز المكونات الجزيئية لعملية أو آلية للاهتمام. ملامح من الخلايا التي هي الأكثر S2 المسؤولة عن فائدتها هي السهولة التي يتم الحفاظ عليها ، لحساسيتها بديعة المزدوج تقطعت بهم السبل التدخل بوساطة الحمض النووي الريبي (دي إس) ([رني) ، وقابلية الإستطراق لالمجهري مضان إما مباشرة أو ثابتة الخلايا.
يمكن زراعة الخلايا S2 في مجموعة متنوعة من وسائل الإعلام ، بما في ذلك عدد من غير مكلفة وسائل الاعلام المتاحة تجاريا المصل الحرة ، كامل المعرفة ، 2. بالإضافة إلى ذلك ، أنها تنمو بشكل أمثل وبسرعة في 21-24 درجة مئوية ، ويمكن تربيتها في مجموعة متنوعة من الحاويات. خلافا لخلايا الثدييات والخلايا S2 لا تتطلب مناخا للوائح ، ولكن بدلا من ذلك بلاء حسنا مع الهواء العادي ، ويمكن أن يستمر حتى في قوارير مختومة.
استكمالا للتخفيف من [رني في الخلايا S2 هو القدرة على تحليل الظواهر بسهولة تجريبيا ، الناجمة عن مرحلة أو مضان المجهري للخلايا الحية أو الثابتة. S2 الخلايا تنمو في الثقافة باعتبارها المونولاير واحد ولكن لا تعرض تثبيط للإتصال به. بدلا من ذلك ، تميل إلى الخلايا تنمو في مستعمرات كثيفة في الثقافات. في منخفض الكثافة ، والثقافات S2 نمت على الزجاج أو البلاستيك نسيج الثقافة المعالجة هي جولة وفضفاضة يعلق. ومع ذلك ، يمكن أن تكون خلايا من خلايا S2 تحسنت كثيرا حثها على نطاق واسع في زراعة تتسطح منهم لفترة وجيزة على السطح المطلي مع lectin ، كونكانافالين A (كونا) 3. ويمكن أيضا أن تكون الخلايا S2 transfected ستابلي مع علامات fluorescently الموسومة للهياكل التسمية أو العضيات الفائدة في الخلايا الحية أو الثابتة. ولذلك ، فإن السيناريو المعتاد لتحليل مجهري للخلايا هو هذا : يتم التعامل مع الأولى ، خلايا S2 (التي يمكن أن تمتلك الجينات المحورة للتعبير عن علامات الموسومة) بواسطة رني للقضاء على البروتين الهدف (ق). يمكن ضبط الوقت رني العلاج للسماح للاختلافات في البروتين بدوره على حركية وتقليل الصدمات خلية / الموت إذا كان الهدف هو بروتين مهم لبقاء. المقبل ، يتم نقل الخلايا المعالجة إلى صحن يحتوي على ساترة قبل المغلفة مع كونا للحث الخلايا على الانتشار والتقيد باحكام الزجاج. أخيرا ، يتم تصوير الخلايا مع اختيار الباحث من وسائط المجهري. S2 خلايا جيدة خاصة بالنسبة للدراسات التي تتطلب رؤية طويلة من الخلايا الحية لأن هذه الخلايا البقاء في صحة جيدة في درجة حرارة الغرفة العادية والغلاف الجوي.
Protocol
Discussion
للخلية حقل البيولوجيا ، فإن نظام مثالي للحفاظ على أن تكون غير مكلفة وسهلة التعامل معها ، وقابلة لمجموعة متنوعة من التقنيات. خلايا ذبابة الفاكهة S2 تلبية هذه الاحتياجات ، وهكذا أصبحت بسرعة هذا النظام خيارا بالنسبة لعدد متزايد من الخلايا مختبرات البيولوجيا.
<p clas…Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وأيد هذا العمل في جزء من المعهد الوطني للسرطان P30 CA23074 ، والجمعية الأميركية لأبحاث السرطان المؤسسية 74-001-31 غرانت ، وجامعة ل. من بوغ GI أريزونا (NCI / CA9506O NIH).
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| S2 cells | ATCC | CRL-1963 | http://www.atcc.org/ | |
| S2 cells | DGRC | stock number 6 | https://dgrc.cgb.indiana.edu/ | |
| S2 cells | Invitrogen | R690-07 | ||
| Sf900 II | Invitrogen | 10902-096 | serum-free medium | |
| HyClone SFX-Insect | Thermo Scientific | SH30278 | serum-free medium | |
| Insect-Xpress | BioWhittaker | 12-730 | serum-free medium | |
| Schneider’s S2 medium | Invitrogen | 11720-034 | Add 10% (final) heat-inactivated FBS to make complete medium. | |
| Fetal bovine serum | Invitrogen | 10438026 | heat inactivated | |
| 100x antibiotic solution | MP Biomedicals | 91674049 | contains penicillin (10000 U/mL), streptomycin (10000 μg/mL), and amphotericin B (25 μg/mL) |
|
| Concanavalin A | MP Biomedicals | 195283 | ||
| Formaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15714 | 32% solution | |
| Methanol | Mallinckrodt Baker | 9049 | anhydrous, ACS grade | |
| Molecular sieves | Acros Organics | 19724 | type 3A |
References
- Schneider, I. Cell lines derived from late embryonic stages of Drosophila melanogaster. J Embryol Exp Morphol. 27, 353-365 (1972).
- Rogers, S. L., Rogers, G. C. Culture of Drosophila S2 cells and their use for RNAi-mediated loss-of-function studies and immunofluorescence microscopy. Nat Protoc. 3, 606-611 (2008).
- Rogers, S. L., Rogers, G. C., Sharp, D. J., Vale, R. D. Drosophila EB1 is important for proper assembly, dynamics, and positioning of the mitotic spindle. J Cell Biol. 158, 873-884 (2002).
- Goshima, G. Genes required for mitotic spindle assembly in Drosophila S2 cells. Science. 316, 417-421 (2007).
