De voorbereiding van Drosophila S2 cellen voor lichtmicroscopie
Summary
Drosophila Schneider (S2)-cellen zijn een steeds populairder systeem voor de ontdekking en functionele analyse van genen. Ons doel is het beschrijven van een aantal van de microscopische technieken die S2 cellen te maken die een steeds belangrijker experimenteel systeem.
Abstract
De ideale experimentele systeem zou zijn goedkoop en gemakkelijk te onderhouden, vatbaar voor een verscheidenheid aan technieken, en zou worden ondersteund door een uitgebreide literatuurstudie en de genoomsequentie database. Gekweekte Drosophila S2 cellen, het product van gedistantieerd 20-24 uur oude embryo's 1, bezitten al deze eigenschappen. Bijgevolg, S2 cellen zijn uitermate geschikt voor de analyse van cellulaire processen, waaronder de ontdekking van de genen die coderen voor de moleculaire componenten van het proces of mechanisme van belang. De kenmerken van S2 cellen die het meest verantwoordelijk zijn voor hun nut zijn het gemak waarmee ze worden onderhouden, hun gevoeligheid voor exquise dubbelstrengs (ds) RNA-gemedieerde interferentie (RNAi), en hun volgzaamheid aan fluorescentie microscopie als live of vaste cellen.
S2 cellen kunnen worden gekweekt in een verscheidenheid aan media, waaronder een aantal goedkope, in de handel verkrijgbare, volledig gedefinieerd, serum-vrije media 2. Daarnaast, ze groeien optimaal en snel bij 21-24 ° C en kan worden gekweekt in een verscheidenheid van containers. In tegenstelling tot de cellen van zoogdieren, hoeft S2 cellen niet nodig een geregelde atmosfeer, maar in plaats daarvan doen het goed met normale lucht en kan zelfs worden gehandhaafd in verzegelde flessen.
Als aanvulling op het gemak van RNAi in S2 cellen is de mogelijkheid om gemakkelijk experimenteel geïnduceerde fenotypes analyseren door fase of fluorescentie microscopie van vaste of levende cellen. S2 cellen groeien in de cultuur als een monolaag maar niet tonen contact remming. In plaats daarvan, cellen hebben de neiging om te groeien in kolonies in dichte culturen. Bij een lage dichtheid, S2 culturen geteeld op glas of weefselkweek behandelde plastic zijn rond en losjes bevestigd. Echter, de cytologie van de S2-cellen sterk verbeterd worden door hen ertoe te uitgebreid plat door kort kweken ze op een oppervlak bedekt met de lectine, Concanavaline A (ConA) 3. S2 cellen kunnen ook stabiel getransfecteerd worden met fluorescent-gemerkte markers te labelen structuren of organellen van belang in levende of vaste cellen. Daarom is de usual scenario voor de microscopische analyse van cellen is dit: ten eerste, S2-cellen (die kan bezitten transgenen te getagd markers te uiten), worden behandeld door RNAi naar een doelwit eiwit (s) te elimineren. RNAi behandeling tijd kan worden gecorrigeerd voor verschillen in eiwit-turn-over kinetiek en naar cel trauma / overlijden te minimaliseren als het doel eiwit is belangrijk voor de levensvatbaarheid. Vervolgens worden de behandelde cellen overgebracht naar een schotel met een dekglaasje aan pre-gecoat met ConA tot cellen te verspreiden induceren en strak houden aan het glas. Tot slot worden de cellen afgebeeld met de keuze van de onderzoeker van de microscopie modi. S2-cellen zijn bijzonder goed voor studies die uitgebreide visualisatie van levende cellen, omdat deze cellen gezond te blijven bij kamertemperatuur en normale atmosfeer.
Protocol
Discussion
Voor de celbiologie veld, zou een ideaal systeem goedkoop te onderhouden, gemakkelijk te manipuleren, en vatbaar voor een verscheidenheid aan technieken. Drosophila S2 cellen voldoen aan deze eisen, en dus ze hebben het systeem van de keuze snel te worden voor een groeiend aantal van de cel biologie labs.
We hebben presenteerde een kort overzicht van de methoden om S2 cellen voor te bereiden op microscopie. Een opmerkelijk hoofde van S2 cellen is het feit dat ze goed groeien in een …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd mede ondersteund door het National Cancer Institute P30 CA23074, de American Cancer Society Institutional Research Grant 74-001-31, en van de Univ. van Arizona GI SPORE (NCI / NIH CA9506O).
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| S2 cells | ATCC | CRL-1963 | http://www.atcc.org/ | |
| S2 cells | DGRC | stock number 6 | https://dgrc.cgb.indiana.edu/ | |
| S2 cells | Invitrogen | R690-07 | ||
| Sf900 II | Invitrogen | 10902-096 | serum-free medium | |
| HyClone SFX-Insect | Thermo Scientific | SH30278 | serum-free medium | |
| Insect-Xpress | BioWhittaker | 12-730 | serum-free medium | |
| Schneider’s S2 medium | Invitrogen | 11720-034 | Add 10% (final) heat-inactivated FBS to make complete medium. | |
| Fetal bovine serum | Invitrogen | 10438026 | heat inactivated | |
| 100x antibiotic solution | MP Biomedicals | 91674049 | contains penicillin (10000 U/mL), streptomycin (10000 μg/mL), and amphotericin B (25 μg/mL) |
|
| Concanavalin A | MP Biomedicals | 195283 | ||
| Formaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15714 | 32% solution | |
| Methanol | Mallinckrodt Baker | 9049 | anhydrous, ACS grade | |
| Molecular sieves | Acros Organics | 19724 | type 3A |
References
- Schneider, I. Cell lines derived from late embryonic stages of Drosophila melanogaster. J Embryol Exp Morphol. 27, 353-365 (1972).
- Rogers, S. L., Rogers, G. C. Culture of Drosophila S2 cells and their use for RNAi-mediated loss-of-function studies and immunofluorescence microscopy. Nat Protoc. 3, 606-611 (2008).
- Rogers, S. L., Rogers, G. C., Sharp, D. J., Vale, R. D. Drosophila EB1 is important for proper assembly, dynamics, and positioning of the mitotic spindle. J Cell Biol. 158, 873-884 (2002).
- Goshima, G. Genes required for mitotic spindle assembly in Drosophila S2 cells. Science. 316, 417-421 (2007).
