Preparación de Drosophila Células S2 para microscopía de luz
Summary
Drosophila Schneider (S2), las células son un sistema cada vez más popular para el descubrimiento y el análisis funcional de los genes. Nuestro objetivo es describir algunas de las técnicas microscópicas que hacen que las células S2 como un sistema experimental cada vez más importante.
Abstract
El sistema experimental ideal sería barato y fácil de mantener, susceptibles de una variedad de técnicas, y sería apoyado por una extensa bibliografía y base de datos de secuencia del genoma. Cultivos de células S2 de Drosophila, el producto de desvincularse 20-24 embriones horas de edad 1, posee todas estas propiedades. En consecuencia, las células S2 son extremadamente bien adaptado para el análisis de los procesos celulares, incluyendo el descubrimiento de los genes que codifican los componentes moleculares del proceso o mecanismo de interés. Las características de las células S2 que son más responsables de su utilidad son la facilidad con que se mantienen, su exquisita sensibilidad a doble cadena (ds) mediada por RNA de interferencia (RNAi), y su docilidad a la microscopía de fluorescencia, ya sea en vivo o fija las células.
S2 células pueden ser cultivadas en una variedad de medios, incluyendo un número de bajo costo, disponibles en el mercado, completamente definido, medio libre de suero 2. Además, crecen de manera óptima y rápida a 21-24 ° C y se pueden cultivar en una variedad de recipientes. A diferencia de las células de mamíferos, las células S2 no requieren de un ambiente regulado, sino hacer bien con el aire normal, e incluso se puede mantener en frascos sellados.
Como complemento a la facilidad de ARNi en las células S2 es la capacidad de analizar rápidamente fenotipos inducidos experimentalmente por fase o microscopía de fluorescencia de células fijas o en vivo. S2 células crecen en la cultura como una sola monocapa, pero no muestran inhibición por contacto. En cambio, las células tienden a crecer en colonias en cultivos densos. A baja densidad, las culturas S2 crecido en el vidrio o el plástico de cultivo de tejidos tratados son redondos y poco adheridas. Sin embargo, la citología de las células S2 puede ser mejorado mediante la inducción de ellos para aplanar ampliamente cultivando brevemente sobre una superficie recubierta con la lectina, concanavalina A (ConA) 3. S2 células también pueden ser transfectadas establemente con marcadores de fluorescencia con etiquetas a las estructuras de la etiqueta u orgánulos de interés en las células vivas o fijas. Por lo tanto, el escenario habitual para el análisis microscópico de las células es la siguiente: las primeras células, S2 (que puede tener para expresar transgenes marcadores etiquetados) son tratados por RNAi para eliminar una proteína diana (s). Tiempo de tratamiento RNAi puede ser ajustado para permitir que las diferencias en las proteínas a su vez-sobre la cinética y para minimizar el trauma de células / la muerte si la proteína diana es importante para la viabilidad. A continuación, las células tratadas se transfirió a una placa que contiene un cubreobjetos pre-recubiertos con ConA inducir a las células para difundir y se adhieren firmemente al vidrio. Finalmente, las células son expuestas con la elección del investigador de los modos de microscopía. S2 células son particularmente buenos para los estudios que requieren la visualización ampliada de células vivas ya que estas células mantenerse saludable a temperatura ambiente y la atmósfera normal.
Protocol
Discussion
Para el campo de la biología celular, un sistema ideal sería barato de mantener, fácil de manipular, y es susceptible de una variedad de técnicas. Células S2 de Drosophila satisfacer estos requisitos, por lo que han convertido rápidamente en el sistema de elección para un creciente número de celular biología de los laboratorios.
Hemos presentado un breve resumen de los métodos para preparar las células S2 para microscopía. Una virtud notable de las células S2 es el hech…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado en parte por el Instituto Nacional del Cáncer P30 CA23074, la Sociedad Americana del Cáncer Investigación Institucional subvención 74-001-31, y la Universidad del. de Arizona GI SPORE (NCI / NIH CA9506O).
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| S2 cells | ATCC | CRL-1963 | http://www.atcc.org/ | |
| S2 cells | DGRC | stock number 6 | https://dgrc.cgb.indiana.edu/ | |
| S2 cells | Invitrogen | R690-07 | ||
| Sf900 II | Invitrogen | 10902-096 | serum-free medium | |
| HyClone SFX-Insect | Thermo Scientific | SH30278 | serum-free medium | |
| Insect-Xpress | BioWhittaker | 12-730 | serum-free medium | |
| Schneider’s S2 medium | Invitrogen | 11720-034 | Add 10% (final) heat-inactivated FBS to make complete medium. | |
| Fetal bovine serum | Invitrogen | 10438026 | heat inactivated | |
| 100x antibiotic solution | MP Biomedicals | 91674049 | contains penicillin (10000 U/mL), streptomycin (10000 μg/mL), and amphotericin B (25 μg/mL) |
|
| Concanavalin A | MP Biomedicals | 195283 | ||
| Formaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15714 | 32% solution | |
| Methanol | Mallinckrodt Baker | 9049 | anhydrous, ACS grade | |
| Molecular sieves | Acros Organics | 19724 | type 3A |
References
- Schneider, I. Cell lines derived from late embryonic stages of Drosophila melanogaster. J Embryol Exp Morphol. 27, 353-365 (1972).
- Rogers, S. L., Rogers, G. C. Culture of Drosophila S2 cells and their use for RNAi-mediated loss-of-function studies and immunofluorescence microscopy. Nat Protoc. 3, 606-611 (2008).
- Rogers, S. L., Rogers, G. C., Sharp, D. J., Vale, R. D. Drosophila EB1 is important for proper assembly, dynamics, and positioning of the mitotic spindle. J Cell Biol. 158, 873-884 (2002).
- Goshima, G. Genes required for mitotic spindle assembly in Drosophila S2 cells. Science. 316, 417-421 (2007).
