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Mesures en temps réel des paramètres de calcium et de contractilité dans les cardiomyocytes dérivés de cellules souches pluripotentes induites par l’homme

Published: May 26, 2023 doi: 10.3791/65326
Automatic Translation
1,2, 1,2,3, 1,2,3, 4, 4, 1,2, 1,2
1Division of Physiology, Amsterdam UMC, Vrije University, 2Heart Failure & Arrhythmias, Amsterdam Cardiovascular Sciences, 3CytoCypher BV, 4Division of Clinical Pharmacology, Vanderbilt School of Medicine

ERRATUM NOTICE

Summary

Ici, une méthode établie est décrite pour effectuer des mesures de contractilité et de calcium dans des cardiomyocytes dérivés de cellules souches pluripotentes induites par l’homme à l’aide d’une plate-forme optique. Cette plateforme permet aux chercheurs d’étudier l’effet des mutations et la réponse à divers stimuli de manière rapide et reproductible.

Abstract

Les cardiomyocytes dérivés de cellules souches pluripotentes induites par l’homme (hiPSC-CM) représentent un outil puissant pour étudier les changements médiés par mutation dans la fonction des cardiomyocytes et définir les effets des facteurs de stress et des interventions médicamenteuses. Dans cette étude, il est démontré que ce système basé sur l’optique est un outil puissant pour évaluer les paramètres fonctionnels des CM-HiPSC en 2D. En utilisant cette plate-forme, il est possible d’effectuer des mesures appariées dans un environnement de température bien préservé sur différentes configurations de plaques. De plus, ce système fournit aux chercheurs une analyse instantanée des données.

Cet article décrit une méthode de mesure de la contractilité des CM-HISP non modifiés. La cinétique de contraction est mesurée à 37 °C sur la base des changements de corrélation des pixels par rapport à un cadre de référence pris à la relaxation à une fréquence d’échantillonnage de 250 Hz. De plus, des mesures simultanées de transitoires intracellulaires de calcium peuvent être acquises en chargeant la cellule avec un fluorophore sensible au calcium, tel que Fura-2. À l’aide d’un hyperinterrupteur, les mesures ratiométriques du calcium peuvent être effectuées sur un point d’éclairage de 50 μm de diamètre, correspondant à la zone des mesures de contractilité.

Introduction

L’insuffisance cardiaque est la principale cause de décès dans le monde. En 2019, les maladies cardiovasculaires ont causé 18,6 millions de décès dans le monde, ce qui représente une augmentation de 17,1 % au cours de la dernière décennie1. Malgré les efforts des chercheurs pour identifier des cibles médicamenteuses afin de prévenir et de guérir l’insuffisance cardiaque, les résultats pour les patients sont encore médiocres2. La différence dans la physiopathologie des modèles animaux par rapport aux humains pourrait être l’un des facteurs sous-jacents du succès limité de l’optimisation du traitement de l’insuffisance cardiaque3. D’autres modèles semblables à ceux de l’homme sont justifiés pour modéliser la maladie et tester la toxicité et l’efficacité de nouveaux composés médicamenteux.

Les cardiomyocytes dérivés de cellules souches pluripotentes induites par l’homme (hiPSC-CM) représentent un outil puissant pour définir les mécanismes pathologiques cellulaires induits par les facteurs de stress, l’ischémie, le métabolisme altéré ou les variantes génétiques pathogènes, ainsi que l’efficacité et la toxicité des interventions médicamenteuses4. Pour définir les effets sur les propriétés fonctionnelles des hiPSC-CM, un système à grande vitesse qui mesure les propriétés systoliques et diastoliques des contractions cellulaires de manière non biaisée et reproductible est nécessaire. Cet objectif global de la présente étude est de démontrer qu’un système basé sur l’optique est un outil puissant pour effectuer des analyses en temps réel des paramètres fonctionnels des CM-CSPhi.

Actuellement, il existe plusieurs plates-formes pour évaluer la contractilité des CM-CSPh. Cependant, les systèmes actuels offrent une lecture lente ou le nombre requis de cellules peut être un défi. Les systèmes de mesure vidéo sans étiquette5,6 reposent sur l’analyse post-hoc des vidéos, ce qui nécessite beaucoup de stockage et manque de retour direct lors de l’acquisition vidéo. En outre, une résolution temporelle et spatiale suffisante est difficile à atteindre et peut entraîner un sous-échantillonnage. D’autres méthodes pour déterminer les propriétés des cardiomyocytes, telles que les courtes répétitions palindromiques groupées régulièrement espacées (CRISPR)/HiPSC-CMs7 éditées par Cas9 avec des rapporteurs fluorescents, pourraient interférer avec la stabilité génétique des cellules et nécessiter une expertise de laboratoire spécialisée.

Pour surmonter les limites mentionnées ci-dessus, un système de mesure unique basé sur l’optique a été développé et introduit dans cette étude. Cette plate-forme permet des mesures de contractilité sur les hiPSC-CM non modifiés en les replaquant simplement sur n’importe quel format de plaque requis, sans aucune limitation de taille de plaque. De plus, les mesures en temps réel permettent l’observation et l’analyse directes des paramètres fonctionnels des CM-HIPSC, et fournissent ainsi un cadre expérimental pour ajuster et optimiser instantanément les protocoles. De plus, l’emplacement de chaque mesure est stocké, ce qui permet des mesures appariées sur le même échantillon, augmentant ainsi la puissance des expériences.

Pour démontrer le système basé sur l’optique, des mesures de contractilité ont été effectuées sur une ligne de contrôle hiPSC-CM. Cette lignée de contrôle hiPSC a été générée à partir du fibroblaste dermique d’un donneur masculin en bonne santé avec un caryotype8 normal. La cinétique de contraction a été mesurée à 37 °C, sur la base des changements de corrélation des pixels par rapport à un cadre de référence pris pendant la relaxation à une fréquence d’échantillonnage de 250 Hz. Comme le début exact de la contraction ne peut pas toujours être déterminé sans ambiguïté, le point de temps auquel 20% de la hauteur maximale a été atteint (temps jusqu’au pic 20%) a été pris comme point de départ pour les mesures du temps jusqu’au pic. Ce faisant, on a constaté moins de variabilité pour ce paramètre au sein d’un échantillon. De même, comme le moment exact auquel le signal revient à la ligne de base est difficile à évaluer, le temps qu’il a fallu pour atteindre 80 % du retour à la ligne de base à partir du pic (temps à la ligne de base 80 %) a été utilisé pour décrire le temps de relaxation.

Les mesures globales de contractilité comprenaient les fréquences de battement au repos, le temps allant de 20% de crête à pic de contraction (TP. Con), et le temps écoulé entre le pic de contraction et 80 % de la valeur de base (TB. Con80) (figure 1B). Pour tester l’effet d’un facteur de stress, les cellules ont été incubées avec de l’isoprénaline (ISO). De plus, coïncidence avec les mesures de contractilité, les transitoires Ca 2+ ont été mesurés en chargeant les cellules avec de l’ester Fura-2-acétoxyméthylique (Fura-2 AM) à une fréquence d’échantillonnage de 250 Hz. Les mesures ratiométriques Ca2+ 9 à l’aide d’un hypercommutateur ont été effectuées sur une zone d’éclairage de 50 μm de diamètre, correspondant à la zone des mesures de contractilité. Les données de mesure du Ca 2+ sont représentées comme le temps allant de 20 % de crête à crête dans le transitoire Ca2+ (TP.Ca) et le temps entre le pic et 80 % de la ligne de base (TB.Ca80) (figure 1C). Un outil rapide et automatique d’analyse des données a été utilisé pour obtenir des paramètres cinétiques contractiles et calciques moyens pour chaque zone.

Protocol

1. Préparation des milieux de culture cellulaire et des réactifs

  1. Préparer le support hiPSC-CM en ajoutant 1 mL de supplément de B27 (50x) à 49 mL de RPMI1640.
  2. Préparer le milieu de replacage en ajoutant d’abord 5 mL de sérum knockout de remplacement à 45 mL de milieu hiPSC-CM. Ensuite, ajoutez 22,5 μL d’inhibiteur de ROCK Y-27632 (dilution de 1:2 000; concentration mère: 10 mM) et mélangez abondamment.
  3. Préparer les plaques revêtues de membrane basale comme décrit ci-dessous :
    1. Décongelez un flacon de membrane basale pendant la nuit au réfrigérateur ou sur une glacière.
    2. Diluer la membrane basale avec une quantité appropriée de milieu Eagle’s medium modifié de Dulbecco/Ham’s F12 (DMEM/F12). Comme chaque lot de membrane basale a une concentration différente, calculer la quantité de DMEM/F12 nécessaire pour atteindre une dilution de 1 mg/1 mL. Fabriquer des aliquotes de 0,5 ou 1 mL pour les conserver à -20 °C.
      REMARQUE : L’étape 1.3.2 doit être effectuée sur de la glace à l’intérieur d’une hotte d’écoulement.
    3. Décongeler l’aliquote de 0,5 mL de la membrane basale et la diluer avec 6 mL de DMEM/F12. Mélanger.
    4. Enduire la plaque en pipetant 250 μL de membrane basale ou de puits dilué dans une plaque de 24 puits. Calculer en fonction de la surface de chaque puits pour différents formats de plaques, par exemple, 1 mL/puits dans une plaque de 6 puits.
    5. Incuber la plaque pendant 1 h dans un incubateur à 37 °C.
  4. Préparer les aliquotes Fura-2 AM en dissolvant Fura-2 AM dans du diméthylsulfoxyde (DMSO), conformément au manuel du fabricant pour préparer des aliquotes de 1 mM. Conserver les aliquotes à -20 °C.

2. Culture de hiPSC-CM

  1. Décongeler un flacon de hiPSC-CMs dans un bain-marie à 37 °C. Transférer le contenu décongelé du flacon dans un tube de 15 mL. Ajouter 10 mL du milieu de replacage goutte à goutte aux cellules.
  2. Centrifuger les cellules pendant 5 min à 100 × g.
  3. Retirer le surnageant et ajouter 1 mL de milieu de replacage. Tuyler doucement de haut en bas pour remettre en suspension la pastille et enlever les amas de cellules.
  4. Utilisez un hémocytomètre ou un compteur de cellules automatisé pour compter le nombre de cellules.
  5. Retirez la membrane basale de la plaque incubée et remplacez-la par le milieu de replacage.
  6. Plaquer les cellules avec une densité cellulaire appropriée sur une plaque de puits 6/12/24/48/96 recouverte d’une membrane basale (par exemple, 250 000 cellules/puits dans une plaque de 24 puits).
    REMARQUE: Pour les expériences transitoires Ca2+ , plaquez les cellules sur des plaques à fond de verre.
  7. Remplacer le milieu par un milieu de culture hiPSC-CM le lendemain, puis rafraîchir le milieu tous les deux jours en utilisant 0,5 mL/puits dans une plaque de 24 puits.
  8. Effectuer les mesures de contractilité une fois que les CM-HISP se sont rétablis après la décongélation et le replacage (3 à 5 jours après le replatage dans ce protocole).
    REMARQUE: En cas de replacage inégal des cellules, il est possible qu’un groupe de cellules ne soit pas en contact avec le reste des cellules replaquées et puisse présenter un schéma de battement irrégulier ou non synchronisé. Pour éviter l’asynchronie, il est conseillé d’avoir une distribution uniforme des cellules et une monocouche synchronisée et bien connectée de hiPSC-CM dans chaque puits.

3. Mesures de contractilité

  1. Allumez le système de mesure optique, la source lumineuse à diodes électroluminescentes (DEL) du microscope et l’ordinateur (voir le tableau des matériaux).
  2. Ouvrez le programme et ouvrez un nouveau fichier. Sous Fichier en haut à gauche de l’écran, cliquez sur Nouveau.
  3. Cliquez sur Collect, choisissez Experiments, puis sélectionnez « iPSC + Calcium ».
  4. Allumez le dispositif de climatisation. Réglez la température à 37 °C et le niveau de CO2 à 5%.
  5. Remplacer le milieu de culture hiPSC-CM par une solution Tyrode (0,5 mL/puits dans une plaque de 24 puits). Remplacez le couvercle de la plaque par le couvercle de la climatisation.
    REMARQUE: Si des mesures transitoires de calcium doivent être effectuées, charger les cellules avec Fura-2 AM, comme décrit dans la section 4.
  6. Placez la plaque à l’intérieur du système de mesure optique une fois que le dispositif de climatisation indique que la température est de 37 °C.
    REMARQUE : La contraction est mesurée à l’aide de conditions de fond clair.
  7. Cliquez sur Ouvrir le chercheur de cellules sous la barre d’outils et attendez qu’un nouvel écran apparaisse. En haut à droite de l’écran, sélectionnez le format de plaque et le puits.
  8. Sélectionnez un puits, choisissez une zone dans le puits pour observer la contraction et la relaxation synchronisées, appuyez sur le bouton Démarrer, cliquez sur Ajouter une mesure. Sélectionnez la durée des mesures dans les paramètres (10 s par zone). Ignorez immédiatement les mesures de contraction asynchronisées et sélectionnez une nouvelle zone.
    REMARQUE: Les transitoires de contractilité en temps réel peuvent être vus sur le moniteur. Pour les contractions synchronisées, un transitoire continu lisse est observé, tandis que pour les contractions asynchronisées, de petits pics supplémentaires sont observés.
  9. Mesurez plusieurs zones dans le puits en fonction de la taille du puits. Par exemple, pour suivre cette étude, mesurez 10 zones par puits dans une plaque de 24 puits. Si seules des mesures de référence sont nécessaires et qu’il n’est pas prévu de tester un composé, passez à l’étape 3.13.
  10. Une fois les zones à l’intérieur d’un puits mesurées, appuyez sur Complet et ouvrez l’instrument de mesure optique pour ajouter le facteur de contrainte/composé au puits (p. ex., 500 nM ISO, dissous dans Tyrode).
  11. Choisissez le temps d’incubation en fonction du composé d’intérêt (2 min avec ISO dans ce protocole).
  12. Cliquez sur Mesure automatique pour permettre à l’instrument de mesure optique d’effectuer des mesures dans les mêmes zones que celles où les mesures de base ont été effectuées, ce qui donne lieu à des mesures appariées dans le puits.
  13. Appuyez sur terminer une fois que toutes les mesures dans le puits ont été effectuées.
  14. Choisissez le puits suivant en haut à droite de l’écran.
  15. Poursuivre les mesures pour tous les puits requis.
  16. Cliquez sur Arrêter une fois que tous les puits requis ont été mesurés et enregistrez le fichier.
    NOTE: La climatisation est utilisée pour maintenir la stabilité du CO2. Cela permet de mesurer l’effet des composés / facteurs de stress sur les CM-HI de manière rapide.

4. Mesures transitoires du calcium

  1. Préparer la solution Tyrode à 37 °C.
  2. Dissoudre les aliquotes Fura-2 AM dans la solution Tyrode de sorte qu’une concentration finale de 1 μM Fura-2 AM soit ajoutée aux cellules.
    REMARQUE: Lorsque vous utilisez Fura-2 AM, assurez-vous que les lumières de la hotte sont éteintes pour minimiser l’exposition à la lumière.
  3. Aspirer le milieu et le remplacer par une solution Tyrode contenant Fura-2 AM.
  4. Incuber pendant 15 min à 37 °C dans un incubateur ou dans le système de mesure optique.
  5. Retirer la solution Tyrode contenant Fura-2 AM, puis laver 2x avec une solution fraîche de Tyrode. Enfin, incuber les cellules dans la solution Tyrode pendant encore 5 minutes à 37 °C pour permettre la désestérification de Fura-2 AM.
  6. Placez la plaque à l’intérieur du système de mesure optique et démarrez les mesures, comme décrit dans la section 3.
    REMARQUE : À l’étape 4.6. En commençant les mesures simultanément avec les mesures de contraction, un transitoire ratiométrique de calcium est enregistré : excitation à 340 nm et 385 nm en point de 100 μm ; émissions collectées à 510 ± 40 nm. En plus des traces de contractilité, des transitoires calciques ratiométriques en temps réel apparaîtront à l’écran.

5. Analyse des données

  1. Pour analyser les données, cliquez sur CytoSolver sur le bureau.
  2. Cliquez sur importer et sélectionnez le(s) fichier(s) à analyser.
  3. Une fois que le programme a effectué l’analyse, observez les transitoires acceptés (bleu) et rejetés (rouge) apparaissant à l’écran (Figure 1A).
    NOTE: Ici, les critères de rejet par défaut suivants, définis par le rapport signal sur bruit (SNR) et la qualité de l’ajustement (R 2), ont été utilisés: R 2 > 0,9 et SNR > 4 pour les transitoires de contraction, et R2 > 0,5 et SNR > 3 pour les transitoires calciques. Ces critères de rejet peuvent être ajustés par l’utilisateur en fonction de la qualité des mesures, de la qualité des cellules et du critère de jugement principal pour le chercheur. Par exemple, si l’intérêt du chercheur est principalement la cinétique de relaxation, les critères pourraient être abaissés pour le temps jusqu’au pic des variables. Si des transitoires calciques très forts sont obtenus, il peut être nécessaire d’augmenter le SNR pour exclure les données plus bruyantes.
  4. Cliquez sur exporter et cochez pour obtenir les données transitoires moyennes. Inspectez les données analysées présentées dans une feuille de calcul.
  5. Éteignez l’ordinateur et tous les autres instruments.

Representative Results

Conformément à ce protocole, des mesures de contractilité, de transitoires Ca2+ et de réponse à un composé dans les CM-HiPSC ont été effectuées. En utilisant ce système de mesure basé sur l’optique, les hiPSC-CM pourraient simplement être replaqués sur les plaques requises et les mesures de contractilité pourraient être effectuées. La contractilité est mesurée dans une région d’intérêt (ROI) de 100 μm x 100 μm à 250 images par seconde en calculant la corrélation des pixels par rapport à un cadre de référence. Le cadre de référence est automatiquement détecté par le système à la fin de la diastole. Simultanément aux mesures de contraction, un transitoire calcique ratiométrique est enregistré.

Dans cette étude, trois cycles différents de différenciation ont été utilisés comme trois réplications biologiques. Pour chaque lot de différenciation, trois puits ont été mesurés en tant que répétitions techniques. Cette étude a été réalisée à l’aide de plaques de 24 puits, et 10 zones à l’intérieur de chaque puits ont été mesurées. Après les mesures, le programme CytoSolver a été utilisé pour analyser immédiatement les données. Les paramètres suivants ont été rapportés: la fréquence de battement au repos, TP. Con, et TB. Con80 des hiPSC-CM de contrôle (figure 2A-C). Pour visualiser la variabilité des données pour chaque paramètre mentionné, les mesures à l’intérieur de chaque puits et les valeurs moyennes de trois puits pour chaque cycle de différenciation sont présentées sous forme de supergraphiques10. Afin de mieux évaluer la variabilité des données pour chaque cycle de différenciation et entre les trois tours, le coefficient de variance (figure 2D) pour chaque paramètre a été calculé. Comme le montre la figure 2D, les valeurs des réplicas techniques correspondant à une réplication biologique se situent dans une plage très proche les unes des autres (c’est-à-dire faible coefficient de variance), ce qui illustre la robustesse de cette méthode.

Cette application est très bien adaptée pour tester les effets des médicaments. Ici, l’effet de 500 nM ISO, un agoniste non sélectif des récepteurs β-adrénergiques, sur la contractilité des contrôles hiPSC-CM a été testé. Ce composé est connu pour augmenter la fréquence cardiaque et exercer un effet lusitropique positif. Comme le montre la figure 3A, l’ISO a considérablement augmenté la fréquence de battement dans tous les puits. L’ISO a également augmenté la cinétique, ce qui se traduit par une diminution du TP. Con et TB. Con80 (figure 3B,C). Dans l’ensemble, lors de l’incubation avec ISO, la fréquence de battement a été significativement augmentée dans tous les puits, ainsi qu’une réduction du temps de contraction et de relaxation, ce qui indique que la réponse attendue à ce composé a été enregistrée par cette plate-forme.

Parallèlement aux mesures de contractilité, des mesures de calcium ont également été effectuées. De la même manière que les données de contractilité (Figure 2), les données de mesure du calcium des CM-HIPSC sont représentées à la Figure 4. Le TB.Ca80 est considérablement plus lent que chez les cardiomyocytes isolés de rat ou de souris, ce qui s’explique en partie par les différences d’espèces et de fréquence cardiaque11, ainsi que par la manipulation immature du calcium dans les hiPSC-CM en raison d’une dynamique calcique plus faible dans le réticulum sarcoplasmique et d’une expression plus faible des protéines de manipulation du calcium par rapport aux cellules primaires12. À l’instar des données sur la contractilité, le coefficient de variance pour les mesures du calcium a été calculé et montre une faible variabilité au sein des répétitions techniques et biologiques (figure 4C).

Figure 1
Figure 1 : Utilisation immédiate de l’outil d’analyse transitoire CytoSolver après l’expérience pour analyser les données. (A) Un exemple des transitoires acceptés (tous en bleu) d’une zone mesurée à l’intérieur d’un puits. Le panneau A1 illustre les transitoires contractiles. Le panneau A2 représente les transitoires calciques. (B) Transitoire moyen de contractilité obtenu à partir de mesures effectuées dans trois puits d’un cycle de différenciation. Pour chaque transitoire unique ou moyen, les données provenant de différents moments temporels jusqu’au pic (TP. Con) et le délai jusqu’à la base de référence (TB. Con) du transitoire de contractilité pourrait être extrait. Comme le début exact de la contraction ne peut pas toujours être déterminé sans ambiguïté, le temps jusqu’au pic de 20% est pris comme point de départ pour les mesures du temps jusqu’au pic. De même, le moment exact auquel le signal revient à la ligne de base est difficile à évaluer. Par conséquent, le temps jusqu’à la ligne de base de 80% est utilisé pour décrire le temps de relaxation. Ici, TP. Con (temps jusqu’au pic - temps jusqu’au pic 20%) et TB. Con 80 (temps jusqu’à la base de référence80% - temps jusqu’au pic) sont utilisés. (C) Données transitoires moyennes sur le calcium obtenues à partir de mesures effectuées dans trois puits d’un cycle de différenciation. À partir de chaque transitoire de calcium unique ou moyen, des données de différents points temporels jusqu’au pic (TP.Ca) et au temps jusqu’à la valeur de référence (TB.Ca) des transitoires de calcium ont pu être extraites. Pour les mesures du temps jusqu’au pic, le point de départ est le temps jusqu’au pic de 20 %, et pour le temps jusqu’à la ligne de base, le point final est le temps jusqu’à la ligne de base 80 %. Dans cette étude, TP.Ca (temps jusqu’au pic - temps jusqu’au pic 20%) et TB.Ca 80 (temps jusqu’à la base de référence 80% - temps jusqu’au pic) sont utilisés. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2
Figure 2 : Mesures de contractilité de base effectuées sur trois cycles différents de différenciation. Trois réplicats biologiques et trois puits pour chaque cycle de différenciation (c.-à-d. trois réplicats techniques). Trois symboles principaux pour chaque cycle de différenciation représentent la valeur moyenne des zones mesurées (les symboles d’arrière-plan dans les couleurs fanées) dans chaque puits. Les données sont présentées sous forme de moyenne ± SEM. Les données concernant la fréquence des battements au repos sont représentées en Hertz et pour TP. Con et TB. Con80, les données sont en secondes. (A) Fréquence des battements au repos. B) Temps jusqu’au pic (TP. Contre). (C) Délai jusqu’à la valeur de référence 80 % (TB. Con80). (D) Pour évaluer la variation entre les données obtenues à chaque cycle et entre les trois cycles de différenciation, le pourcentage du coefficient de variance a été calculé en utilisant les valeurs moyennes de chaque puits. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 3
Figure 3: Mesures de contractilité à l’inclusion (-) et après incubation avec ISO (+) sur trois puits à partir de trois cycles de différenciation. (A) La fréquence de battement au repos (-) et la fréquence de battement après incubation avec 500 nM ISO (+). B) Temps jusqu’au pic (TP. Con) mesures au départ et après incubation avec ISO. (C) Délai jusqu’à la valeur de référence 80 % (TB. Con80) mesures au départ et après incubation avec ISO. Pour évaluer l’effet de l’ISO sur les paramètres de contractilité, une Anova bidirectionnelle avec correction de Bonferroni a été réalisée. Les données sont présentées sous forme de moyenne ± SEM. Les données concernant la fréquence des battements au repos sont représentées en Hertz et pour TP. Con et TB. Con80, les données sont représentées en secondes. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 4
Figure 4 : Mesures transitoires de calcium de base effectuées sur trois puits à partir de trois cycles de différenciation. (A) Temps jusqu’au pic (TP.Ca) et (B) Temps jusqu’à la valeur de référence 80 % (TB.Ca80) des transitoires calciques. Les données sont présentées sous forme de moyenne ± TP.Ca SEM. et TB.Ca80 données sont représentées en secondes. (C) Pour évaluer la variation entre les données obtenues à chaque cycle et entre les trois cycles de différenciation, le pourcentage du coefficient de variance a été calculé en utilisant la valeur moyenne de chaque puits. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Discussion

Dans cette étude, une méthode est décrite pour effectuer des mesures transitoires de contractilité et de calcium sur les CSPhi-CM et étudier l’effet des facteurs de stress / médicaments sur ces cellules. Les mesures de contractilité, les mesures ratiométriques du calcium et la réponse à l’ISO ont été effectuées sur trois cycles différents de différenciation en tant que répétitions biologiques. Pour chaque répétition biologique, des mesures ont été effectuées sur trois puits en tant que réplications techniques. La raison d’effectuer les mesures de cette manière était de s’assurer que la variabilité biologique et la variabilité technique de l’échantillon et de la plate-forme pouvaient être évaluées. Outre la prise en compte du nombre approprié de répétitions biologiques et techniques, les conditions de culture hiPSC-CM pourraient jouer un rôle important pour obtenir des résultats constants et robustes. Il est important d’être cohérent avec des critères, tels que l’âge des CM-HiPSC, la composition du milieu, les conditions de replacage et le temps d’incubation du composé pendant les mesures. Dans cette étude, il a fallu en moyenne 568 ± 24 s pour mesurer 11 zones deux fois pendant 10 s dans un puits. Cela inclut un temps d’incubation ISO de 79 ± 11 s. Cela revient à environ 10 minutes par puits, ce qui devrait permettre aux chercheurs de mesurer une plaque complète de 24 puits en ~4 h. La climatisation est utilisée pour maintenir la stabilité du CO2. Cela permet de mesurer l’effet des composés / facteurs de stress sur les CM-HI de manière rapide.

Pour mesurer la fonction contractile des CM-iPSC, il existe plusieurs systèmes reposant sur l’optogénétique13 ou la microscopie vidéo sans marquage 5,6. Les systèmes optogénétiques sont assez complexes et nécessitent des techniques spéciales pour obtenir des données électrophysiques et/ou de contractilité. D’autres systèmes s’appuient sur l’analyse post-hoc des vidéos, ce qui nécessite beaucoup de stockage et manque de retour direct lors de l’acquisition vidéo. En outre, il est difficile d’obtenir une résolution temporelle et spatiale suffisante, ce qui peut entraîner un sous-échantillonnage. De même, les hiPSC-CM édités par CRISPR/CAS-9 avec des rapporteurs fluorescents7 peuvent introduire des effets indésirables sur le comportement des cardiomyocytaires. L’utilisation de colorants fluorescents pour les mesures de contraction-relaxation est également une approche élégante, mais limite la réalisation d’expériences sur le même échantillon sur une période plus longue14.

Cette plate-forme de mesure basée sur l’optique, cependant, pourrait être utilisée pour mesurer les temps de contraction-relaxation sans utiliser de colorant fluorescent ou de méthodes invasives. Cependant, comme la corrélation des pixels ne fournit pas d’informations spatiales, cette méthode ne peut pas être utilisée pour mesurer la force de la contraction, mais peut seulement détecter de manière fiable les changements dans la vitesse de contraction et de relaxation. Le système de mesure introduit est à température contrôlée et peut acquérir des données de calcium et de contractilité en temps réel à une résolution de > 200 images par seconde. De plus, l’emplacement de chaque mesure est stocké, ce qui permet des mesures appariées, augmentant ainsi la puissance des expériences. De plus, cette plateforme offre aux chercheurs la possibilité de stocker des données et de les analyser instantanément après l’expérience. Dans l’ensemble, ce système de mesure basé sur l’optique s’avère être une méthode prometteuse pour étudier les mécanismes pathologiques cellulaires, peut évaluer l’effet des composés sur la fonctionnalité des CSPhi-CM et peut être utile dans le processus préclinique de criblage de médicaments.

Disclosures

EM est un employé de CytoCypher BV. MH est le PDG de CytoCypher BV. Les autres auteurs déclarent que la recherche a été menée en l’absence de toute relation commerciale ou financière qui pourrait être interprétée comme un conflit d’intérêts potentiel.

Acknowledgments

Cette recherche a été financée en partie par la subvention Eurostars Estars2 113937 CARDIOMYO (EM & DK) et la subvention NWO-VICI 91818602 (JV).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
µ-Plate 24 Well Black ID 14 mm ibidi 82421
B-27 Supplement (50x) Thermo Fisher 17504044
CytoSolver transient analysis tool CytoCypher A fast automatic data analysis tool
DMEM/F-12 Thermo Fisher 11320033
Fura-2, AM Thermo Fisher F1221
Isoprenaline hydrochloride Merck 15627
KnockOut™ Serum Replacement Thermo Fisher 10828010
Matrigel Merck CLS3542C Basement membrane
MultiCell CytoCypher with Nikon 20x Super Fluor objective and 730 nm LED light source and Ionwizard software CytoCypher Optics-based measurement system
ROCK inhibitor Y-27632 Tocris 1254
RPMI 1640 Thermo Fisher 11875119
Tyrode Self-made solution with final concentration of the following components: NaCl 134 mM, KCl 5 mM, Hepes 12 mM, MgSO4 1.2 mM, NaH2PO4 H2O 1.2 mM, Glucose 11 mM, Sodium Pyrovate 5 mM, 1 mM CaCl2

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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Biologie numéro 195

Erratum

Formal Correction: Erratum: Real-Time Measurements of Calcium and Contractility Parameters in Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes
Posted by JoVE Editors on 12/13/2023. Citeable Link.

An erratum was issued for: Real-Time Measurements of Calcium and Contractility Parameters in Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes. The Authors section was updated from:

Rafeeh Dinani1,2
Emmy Manders1,2,3
Michiel Helmes1,2,3
Lili Wang4
Bjorn Knollmann4
Diederik W. D. Kuster1,2
Jolanda van der Velden1,2
1Division of Physiology, Amsterdam UMC, Vrije University
2Heart Failure & Arrhythmias, Amsterdam Cardiovascular Sciences
3CytoCypher BV
4Division of Clinical Pharmacology, Vanderbilt School of Medicine

to:

Rafeeh Dinani1,2
Emmy Manders1,2,3
Michiel Helmes1,2,3
Lili Wang4
Bjorn C. Knollmann4
Diederik W. D. Kuster1,2
Jolanda van der Velden1,2
1Division of Physiology, Amsterdam UMC, Vrije University
2Heart Failure & Arrhythmias, Amsterdam Cardiovascular Sciences
3CytoCypher BV
4Division of Clinical Pharmacology, Vanderbilt School of Medicine

Mesures en temps réel des paramètres de calcium et de contractilité dans les cardiomyocytes dérivés de cellules souches pluripotentes induites par l’homme
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Dinani, R., Manders, E., Helmes, M., … More

Dinani, R., Manders, E., Helmes, M., Wang, L., Knollmann, B. C., Kuster, D. W. D., van der Velden, J. Real-Time Measurements of Calcium and Contractility Parameters in Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes. J. Vis. Exp. (195), e65326, doi:10.3791/65326 (2023).

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