Summary
本文提出了一种简化的方案，用于使用创新的口堵在小鼠中建立牙髓炎模型，然后进行随后的组织学分析。
Abstract
牙髓炎是自然牙齿脱落的常见原因，会导致发炎牙髓中的坏死和生物活性丧失。揭示牙髓炎的机制及其有效治疗是牙髓病学研究的持续重点。因此，了解牙髓内的炎症过程对于改善牙髓保存至关重要。与其他体 外 实验相比，鼠牙髓炎模型为观察牙髓炎的病理进展提供了更真实和遗传多样化的背景。然而，尽管小鼠具有成本效益和可及性，但由于它们的体积小、协调性差和耐受性低，使用小鼠会带来困难，使口腔内和牙科手术复杂化。该协议引入了一种新颖的设计和应用，即口腔堵嘴以暴露小鼠牙髓，从而促进更有效的口内手术。口腔堵嘴由大多数牙医都可以轻松使用的牙弓组成，可以显着加快手术准备，即使是第一次手术也是如此。Micro-CT、苏木精-伊红（hematoxylin-eosin，HE）染色和免疫荧光染色（immunofluescing sing）检测形态和细胞表达的变化。本文的目的是帮助研究人员建立一种更具可重复性且要求更低的程序，以使用这种新型的口腔堵嘴创建牙髓炎症模型。
Introduction
牙髓是牙齿的一个组成部分，负责多种基本功能，如营养供应、牙本质形成、感觉功能和防御反应1。然而，被硬组织包围的牙髓容易受到深龋、牙髓炎、创伤或后续治疗的伤害和损伤 2,3。功能性牙髓的缺失会增加牙齿脆弱的风险4.此外，年轻恒牙牙髓活力的丧失会对牙齿成熟产生不利影响，而目前的假牙技术无法恢复健康牙髓提供的神经反馈4.这种情况促使研究人员探索管理发炎牙髓的替代解决方案，而不仅仅是去除。
2007 年，Murray 等人开始将组织工程应用于再生牙髓学，从而引发了人们对牙髓保存和再生的兴趣5。然而，发炎的牙髓组织带来了挑战，因为细胞会释放 IL-6 等炎症因子，IL-6 会招募炎症细胞并导致细胞坏死、牙髓活力丧失和功能恢复并发症 6,7。因此，了解炎症和相关的细胞死亡对于保护重要牙髓的进展至关重要。已经进行了许多实验来探索炎症牙髓在体内或体外的分子生物学 8,9。尽管像 2D 或 3D 细胞培养这样的体外实验已经发展了多年，并且已经变得成熟并广泛用于测试牙髓细胞对炎症因子的反应，但这些实验无法反映牙髓组织与全身免疫系统之间的相互作用10。如果正在研究的现象来源于其他组织来源的细胞，如免疫、血管和神经系统，那么纯牙髓细胞培养将导致死胡同。因此，体内实验是非常必要和具有参考意义的。
小鼠因其成本效益、高生育率和活力而日益成为 体内炎症研究中的常见选择。然而，目前尚无针对小鼠牙髓炎模型的综合方案，可作为参考。小鼠的小尺寸和它们对刺激的敏感性在实验过程中构成了重大挑战。观察隐藏在小鼠口腔深处的微小牙齿通常需要使用悬臂显微镜，尽管桌面显微镜在实验室中更为普遍。没有张口器需要其他人的帮助。为了解决这个问题，该小组使用现成的材料设计了一种口腔堵嘴器，旨在为构建小鼠牙髓炎模型提供标准化和可重复的协议。本文详细介绍了该过程，涵盖 C57 小鼠的术前准备、固定、牙髓暴露手术和样本采集。该协议建议使用口腔堵嘴，提供有关其结构、生产和应用的信息，以方便其他研究人员复制该程序。
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Protocol
本研究的实验程序经四川大学华西口腔医学院伦理委员会（WCHSIRB-D-2021-125）批准。成年C57BL / 6小鼠购自中国成都的Gempharmatech实验动物公司。上颌第一磨牙的整个牙冠在出生后 21 天萌出。手术小鼠的年龄应大于21天，具有正常活力11。在这里，使用 6 至 8 周龄的小鼠进行建模。 图 1 是一个流程图，显示了所使用的协议。
1.术前准备（图2）
- 获取以下仪器：立体显微镜、固定板、医用胶带、口腔堵嘴、直径0.6mm的微创牙科毛刺、牙科高速牙科手机、8# C+锉、加热垫、1 mL注射器、无菌棉球、眼钳。
- 获得以下药物：麻醉混合物，兽药膏。
2.口塞的准备
- 通过腹膜内注射麻醉混合溶液（10%盐酸氯胺酮+ 5%甲苯噻嗪+ 85%无菌等渗盐水）以0.007mL / g体重称重并麻醉小鼠，并通过脚趾捏法确认适当的麻醉。将眼科润滑膏涂抹在眼睛上，以防止手术时因干燥而造成眼睛受伤。
注意：医用帽子、口罩、手套和工作服以及其他基本保护措施是必要的。确保手术环境和小鼠室清洁安全。在整个过程中，用于热支撑的加热垫是必要的。 - 如下所述准备嘴巴堵嘴（图3）。
- 获得以下材料：直径为 8 μm 的正畸弓丝、年轻的环弯曲钳、重型钢丝钳、记号笔、长度为 3 mm、横截面直径为 1 mm 的橡胶帽。
- 首先，用左手拉直弓形线进行固定，右手的拇指、食指稍微弯曲以抵挡线的弧度。重复此动作几次，将有助于弯曲到正确的三维角度。
- 使用Yong环弯曲钳将梯形（图3C，a-l-k-b）的顶部边缘（图3G，a-i）弯曲在弓形丝的中点长约8 mm。确保点 a（图 3）位于钳嘴的边缘。
- 用左手握住钳子，用右手拇指和食指夹住弓线的自由端，从a点弯曲弓线，形成约120°的角度。在点i处复制上一个操作（图3G）。将弓形线放在水平台上而不撬动，检查弓形线是否在一个平面上。
- 每侧留出约 9 毫米的长度（图 3D、a-b、l-k），并使用与步骤 2.2.4 相同的技能将自由端弯曲到 75° 角，同时确保每条边都在一个平面上。用钳嘴的尖端弯曲这个锐角。
- 找到距离 b 点约 5 毫米的 c 点。按照相同的技巧在点 c 上弯曲 105° 角。在距离 c 点 5 毫米的 d 点再弯曲 105° 角。距 d 点约 4.5 mm，找到 e 点。在点 e 处弯曲自由端以形成约 100 -105° 的角度（图 3E）。
注意：我们使用的 6-8 周龄的 C57 小鼠约为 20 g。5毫米的间距不仅可以卡住小鼠的上下颚而不动弹，而且不会压迫小鼠的皮肤而引起不适。如果使用其他种类或年龄的小鼠，请根据实际情况调整c-d和i-h部分的长度（图3E，G）。 - 为下颌部分弯曲一个额外的压舌板（图3G，j-i-h-g）。
- a-b-c零件在l-k-j零件上的重复弯曲步骤。同时夹紧 i-k 和 k-j 零件，并在 j 点弯曲自由端，使其垂直于 i-k-j 平面。夹紧点 i 距点 j 5 mm，弯曲自由端以使其平行于 i-k-j 平面和 c-d 部分（图 3H）。
- 从 i 点起留 5 mm 长度，在 h 点处，将拱形弯曲垂直于 i-h 部分并平行于 j-i-h 平面。在距点 h 5 毫米处找到点 g。夹紧 j-i-h-g 平面并弯曲对称于 k-j 部分的自由端。然后，点f之后的自由端应与点e的自由端对称（图3H）。
- 将橡胶帽放在自由端（图3F）。
3. 固定
- 将小鼠仰卧固定在固定板上，四肢用皮胶带固定。用拇指和食指压缩嘴巴的自由端。
- 将鼠标前门牙固定在两条手臂的梯形凹槽中。确保带有压舌板的手臂用于下颌骨。调整嘴巴堵嘴，确保老鼠的舌头被固定但不会缺血。
4. 牙齿评估
- 确保手术时上颌第一磨牙应没有龋齿、外伤和牙龈生成。确保周围的牙龈没有发红、肿胀或瘘管。确保对面的牙齿健康，并可以作为健康的对照组。
5. 纸浆暴露
- 使用牙齿毛刺以 20,000 rpm 的速度在上颌第一磨牙的咬合侧钻孔。确保去除牙釉质。仅在牙本质的浅层中保持牙科手机的操作，以防止对牙髓组织进行过度热刺激12.
- 同时，在手术过程中每 3 分钟使用注射器将生理盐水滴在牙齿上，以防止过热。
- 将 8# 或 10# C+ 锉刀放在钻坑的最低位置，然后刺穿最后一个牙本质，露出牙髓室。当局部牙本质被彻底去除时，会有一种明显的坠落感。不要探得太深，否则牙髓组织可能会从牙髓室中带出。
- 清洁牙齿周围的碎片。取下嘴巴堵嘴;手术已经完成。使用对面的上颌第一磨牙作为对照，无需手术。
6. 术后护理
- 手术后，皮下给予卡洛芬（5mg / kg），并将小鼠置于化学热加热垫上，以俯卧姿势，直到从麻醉中恢复。喂老鼠并提供饮用水。恢复过程应该受到监督。在小鼠完全恢复之前，其他动物不应在同一腔室中。
7. 样本采集和储存
- 在手术后 24 小时或根据实验9 的任何其他时间点，在深度麻醉条件下对颈椎脱位的小鼠实施安乐死。用眼科剪刀剪开附着在上颌骨和颧骨上的骨骼肌。去除骨骼、额骨和软组织，取出带有上颌磨牙的蚋臼片。
注意：根据 He 等人的说法，建议在手术后不到 72 小时收集牙髓炎样本，以避免牙髓组织广泛坏死13。 - 矢状地将蚊蚋石分成两半，并将组织储存在PBS（pH 7.4）中的4%多聚甲醛中，在4°C下进行24小时固定。
8. 组织学分析
- 用磷酸盐缓冲盐水（PBS）洗涤组织，并在每日更换的5%EDTA和4%蔗糖的PBS（pH 7.4）脱钙溶液中脱钙，在4°C下2-4周10。
- 将 1/2 蚊蚋石嵌入石蜡中，并确保没有牙齿的矢状面位于组织盒的底部。
- 用石蜡切片机将石蜡块切成5μm厚的切片。根据显微镜下观察到的近端、远端、上部和下部关系调整石蜡块的角度，以确保可以切割完整的冠髓和第一磨牙的穿孔。
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Representative Results
在3,6-8周龄C57BL / 6小鼠的右上颌第一磨牙上进行上述程序，同时保留左上颌第一磨牙作为对照。空白对照、12 h牙髓炎和24 h牙髓炎样品的组织学和免疫荧光结果用于示范。
根据 Goldman 等人 15 的 CT 分析方案，通过 图 4 A-C 中的显微 CT 和重建建模确认了牙髓暴露。来自对照侧和手术侧的上颌第一磨牙的矢状面切片都进行了 HE 染色（图 5）。显示了伤口边缘的牙髓组织坏死和细胞形态崩解。坏死主要集中在穿孔附近的牙髓组织，未开口一侧的牙髓组织形状正常。24 h时，包括根髓在内的大部分牙髓组织形态完整。（图 5）。
对照中IL-614 表达量低，12 h创面周围可观察到少量IL-6,24 h时IL-6表达明显升高。此外，IL-6的表达主要集中在伤口边缘和中牙髓角（图6）。 在图 6 D，E 中，IL-6+ 牙髓细胞的数量和 IL-6+ 细胞占牙髓细胞总数的比率在三个时间点随着时间的推移而增加。可以认为，该区域在纸浆暴露后逐渐发展为炎症并加重。
我们邀请了 5 位从未对 C57 小鼠的上颌牙齿进行过手术的同事，计算他们按照传统程序固定小鼠上下颌（第 1 阶段）和暴露小鼠上颌第一磨牙（第 2 阶段）所需的时间，参考 Goldman 等人发表的协议或我们的协议与口堵15.还计算了在显微镜下将钻头正确放置在小鼠上颌第一磨牙上的时间以进行分析。 图3 J，K 结果表明，与传统方式相比，小鼠口腔固定和找到上颌第一磨牙的时间明显缩短（P<0.05）。使用口腔堵嘴可以提高手术效率，降低手术难度。
图 1：纸浆暴露程序的流程图。 （A） 用嘴堵固定后，小鼠的上颌第一磨牙应在显微镜下完全暴露。（B）使用带有微创牙齿毛刺的高速牙科手机去除咬合牙釉质和第一磨牙的浅表牙本质，但注意不要直接穿透牙本质，以免过热对牙髓造成过度影响。（C） 使用 8# C+ 锉穿透剩余的牙本质并露出牙髓。（D） 手术后 24 小时采集样本。HE和免疫荧光染色证明，此时可以建立牙髓炎模型。 请点击这里查看此图的较大版本.
图 2：用于纸浆暴露程序的设备。 （A） 牙科高速牙科手机的立体显微镜和电机。（B） 8# C+锉刀、微创牙科毛刺、口腔堵嘴、镊子和牙科高速牙科手机。 请点击这里查看此图的较大版本.
图 3：制作嘴巴堵嘴。 （A） 弯曲电线，使嘴巴堵住两个工作臂。（B-C）下颌骨弯曲舌刮刀的步骤。（D-E）上颌骨没有舌刮刀。（F、H）需要橡胶帽或弯曲的末端来保护受伤不被刺破。（七）三观的口塞作佐鉴。（一）口腔堵嘴的临床使用。（J） 初学者分别使用传统固定方法和嘴巴堵嘴固定上下颌（第一阶段）的平均时间。（K） 初学者分别使用传统固定方法和口塞法清楚地找到上颌第一磨牙（第 2 阶段）的平均时间。 请点击这里查看此图的较大版本.
图 4：手术后的磨牙的显微 CT 分析，穿孔用红色虚线标记。 （A） 牙齿的矢状面，确保牙髓室底部不存在穿孔。（B）日冕面。对应于（A）中的穿孔，可以观察到用红色虚线圈出的牙釉质牙本质的完全渗透。（C）CT重建模型的咬合平面。用红色虚线圈出的穿孔位置以更直观的方式确认，通过穿孔可以观察到纸浆室的地板。（D-G）治疗的术中照片。（D） 检查小鼠的上颌第一磨牙，确保没有蛀牙或畸形。（E） 使用微创毛刺去除牙釉质和浅牙本质。从图像中可以看出，在牙齿的咬合面上可以观察到一个凹坑（用白虚线圈出），没有穿孔。（F） 使用 8# C+ 锉刀穿透剩余的牙本质，如果没有手支撑，锉刀可能会卡在牙齿中。（G） 当锉刀被移除时，牙齿有一个粉红色的穿孔，表明牙髓成功暴露。 请点击这里查看此图的较大版本.
图 5：苏木精-伊红染色。 （A） 未经处理的第一磨牙的整体视图以进行控制。（A-1,2,3）对应于面板 （A） 中 1、2、3 的高放大倍率数字。牙髓组织3个位置形状完整，成牙细胞排列有序。（B） 手术后 12 小时牙齿的整体视图。（B-1,2,3）对应于面板 （B） 中 1、2、3 的高放大倍率数字。1 号位和 2 位的牙髓组织形状总体上完好无损。在穿孔附近可以观察到坏死。（C） 手术后 24 小时牙齿的整体视图。（C-1,2,3）对应于面板 （C） 中 1、2、3 的高放大倍率数字。坏死从单个牙髓角延伸到附近的牙髓组织。但大多数牙髓组织，包括根牙髓，在形态上都是完整的。 请点击这里查看此图的较大版本.
图 6：免疫荧光染色。 （A） 未经处理的第一磨牙的整体视图以供对照。（A-1,2,3）对应于面板 （A） 中 1、2、3 的高放大倍率数字。几乎没有观察到IL-6的表达。（B） 手术后 12 小时牙齿的整体视图。（B-1、2、3）对应于面板 （B） 中 1、2、3 的高放大倍率数字。增加的 IL-6 集中在 B-3 所示穿孔附近的组织中。在B-1,2中没有观察到明显的变化。（C） 手术后 24 小时牙齿的整体视图。（C-1、2、3）对应于面板 （C） 中 1、2、3 的高放大倍率数字。IL-6在C-2,3中的表达显著增加。（D） 对照中 IL-6+ 牙髓细胞总量，12 h 牙髓暴露，24 h 牙髓暴露免疫荧光染色结果。（E） IL-6+ 细胞占对照牙髓细胞总量的比率、12 小时牙髓暴露、24 小时牙髓暴露免疫荧光染色结果。 请点击这里查看此图的较大版本.
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Discussion
作为牙齿内孤立的软组织，牙髓在维持牙齿的生物活性方面发挥着至关重要的作用，但仍然高度敏感。保留这种重要的牙髓已成为最近牙髓治疗中首选的初始方法，因此需要全面了解牙髓的炎症机制16。炎症微环境的时空波动和牙髓炎中驻留细胞类型之间的相互作用使其通过 体外 研究的研究变得复杂11.相反， 体内 研究通过复制在人类中发现的生理环境来提供益处。利用实验小鼠，特别是那些具有过表达或敲低基因的小鼠，为假设验证提供了一种有效的工具。然而，实验室中经常使用的 C57 小鼠由于体积小且缺乏协调性而带来了挑战，这使得对牙齿施加刺激成为问题17。为了解决这个问题，需要对新型口腔堵嘴进行全面的解释，以帮助研究人员在小鼠的口腔内进行手术。此外，本文概述了通过使用口腔堵嘴在小鼠第一磨牙上暴露牙髓来建立牙髓炎模型的方案，从而为后续研究提供有价值的指导。
经过多次迭代，成功设计出一种易于构建的可扩展口塞。 图 3 提供了口塞的尺寸和三视图示意图。该协议通过采用梯形设计代替弧形设计，大大简化了线材弯曲过程。口腔堵嘴使用直径为 0.8 毫米的正畸弓形钢丝，它平衡了防止鼠标嘴巴滑落的需求并提供足够的张开力。此外，正畸弓钢丝的弹性可以保护小鼠的颞下颌关节。口腔堵嘴结构紧凑，耐腐蚀，可储存在装有酒精的 50 mL 离心管中，以便重复使用。尽管老鼠的咬合压力很大，但嘴巴塞在口中保持稳定，使研究人员能够在显微镜下独立操作。应该注意的是，嘴巴堵嘴的大小可以调整以适应不同的小鼠体型。如果嘴巴伸展超过小鼠的极限，应立即取下嘴巴塞，以避免对颞下颌关节 （TMD） 或颌面部肌肉造成伤害。
He 等人的报告表明，牙髓暴露后 24 小时可以检测到坏死，大多数牙髓组织在 72 小时18 后坏死。因此，必须在这72小时窗口内收集牙髓组织，以避免由于过多的死细胞而导致的无效实验结论。将 C+ 锉刀插入牙髓室时，必须避免反复旋转和深推，以免对牙髓组织造成过度损伤。如果在手术过程中发生大量出血，建议使用小棉球轻轻去除血液，以防止咳嗽。该手术应仅在小鼠上颌骨的一侧进行，因为两侧同时建模可能会对模型准确性产生负面影响，这可能会导致饮食摄入并发症。手术后，建议不要给小鼠服用抗炎药或抗生素。
嘴巴堵嘴虽然能有效保持小鼠的嘴巴张开，但在手术部位方面存在局限性。下颌后牙由压舌板压住的舌头保护，通常不清晰可见。因此，该手术仅适用于上颌牙齿或下颌前牙的手术。如果手术超过 20 分钟，建议每 10 分钟让小鼠休息一次，因为嘴巴堵嘴的稳定性取决于拮抗小鼠的咬合力。C57小鼠因其快速繁殖和可用性而被选中，对各种刺激敏感;因此，轻微过量的药物或刺激可能是致命的。此外，他们的牙齿体积小，需要更高的组织切片技能水平。
总之，牙髓炎症和坏死是牙髓再生的紧迫挑战。这项研究全面展示了在小鼠中创建牙髓炎模型，免疫荧光结果验证了炎症因子。本文提出了一种新颖、方便的嘴巴堵嘴设计，它通过保持鼠标的嘴巴张开而不受舌头干扰，为操作员提供畅通无阻的视线。然而，下颌后牙的手术仍然是一个挑战。考虑到使用实验小鼠的优势，小鼠的牙髓建模具有巨大的前景，并且计划预计技术门槛会进一步降低。
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Disclosures
作者声明没有利益冲突。
Acknowledgments
本研究由中国国家自然科学基金U21A20368（L.Y.）、82101000（H.W.）和82100982（F.L.）以及四川省科技计划2023NSFSC1499（H.W.）资助。所有原始数据和图像均包含在本文中。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Animal | |||
| C57/B6J mice | Gempharmatech Experimental Animals Company | C57/B6J | For the establishment of pulp exposure |
| Equipment | |||
| 1 mL syringe | Chengdu Xinjin Shifeng Medical Apparatus & Instruments Co. LTD. | SB1-074(IV) | Apply in drug injection. |
| 8# C+ file | Readysteel | 0010047 | Apply in exposing the roof of pulp chamber. |
| Anesthesia Mix solution | 10% ketamine hydrochloride+ 5% xylazine + 85% sterile isotonic saline. | ||
| DAPI Staining Solution | Beyotime | C1005 | Apply in immunofluorescence staining for counter-staining of nucleus. |
| Dental high-speed dental handpiece | Jing yuan electronic commerce technology | WJ-422 | Apply in pulp exposure. |
| Heavy wire cutter | Jirui Medical Instrument Co., Ltd. | none | Apply inarc cutting. |
| Hematoxylin and Eosin Stain kit | Biosharp | BL700B | For the histological analysis of the slides. |
| IL-6 antibody | Novus | NBP2-89149 | Apply in immunofluorescence staining to detect the inflammation of the dental pulp. |
| Ketamine(Ketamine hydrochloride) | Vet One, Boise, Idaho, USA | C3N VT1 | 100mg/kg, IP. Apply in nesthetization. |
| Medical tap | 3M | 1530 | Apply in mice immobilization. |
| Orthodontic arch wire | Shanghai Wei Rong Medical Apparatus Co. LTD. | K417 | Diameter of 8µm |
| Round dental burr (0.6 mm) | Shofu global | 072208 | Apply in removing enamel and shallow layer of dentin. |
| Young loop bending plier | Jirui Medical Instrument Co., Ltd. | none | Apply in arc bending. |
References
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