Summary
Bu makale, yenilikçi bir ağız tıkaç kullanarak farelerde bir pulpitis modeli oluşturmak için kolaylaştırılmış bir protokol ve ardından müteakip histolojik analiz sunmaktadır.
Abstract
Doğal diş kaybının yaygın bir nedeni olan pulpitis, iltihaplı diş pulpasında nekroza ve biyoaktivite kaybına yol açar. Pulpitisin altında yatan mekanizmaların çözülmesi ve etkili tedavisi, endodontik araştırmaların devam eden bir odak noktasıdır. Bu nedenle, diş pulpasındaki enflamatuar süreci anlamak, pulpanın korunmasını iyileştirmek için hayati önem taşır. Diğer in vitro deneylerle karşılaştırıldığında, bir murin pulpitis modeli, pulpitisin patolojik ilerlemesini gözlemlemek için daha otantik ve genetik olarak çeşitli bir bağlam sunar. Bununla birlikte, maliyet etkinliği ve erişilebilirliğine rağmen farelerin kullanılması, küçük boyutları, zayıf koordinasyonları ve düşük toleransları nedeniyle ağız içi ve diş prosedürlerini karmaşıklaştıran zorluklar doğurmaktadır. Bu protokol, fare pulpasını ortaya çıkarmak için yeni bir ağız tıkaç tasarımı ve uygulaması sunarak daha verimli ağız içi prosedürleri kolaylaştırır. Ağız tıkacı, çoğu diş hekimi tarafından kolayca bulunabilen bir diş kemerinden oluşur ve ilk kez yapılan prosedürler için bile cerrahi hazırlığı önemli ölçüde hızlandırabilir. Morfoloji ve hücre ekspresyonundaki değişiklikleri tanımlamak için mikro-BT, hematoksilen-eozin (HE) boyaması ve immünofloresan boyama kullanıldı. Bu makalenin amacı, araştırmacıların bu yeni ağız tıkaç kullanarak bir pulpa iltihabı modeli oluşturmak için daha tekrarlanabilir ve daha az talepkar bir prosedür oluşturmalarına yardımcı olmaktır.
Introduction
Dişin ayrılmaz bir parçası olan diş pulpası, besin temini, dentin oluşumu, duyusal fonksiyon ve savunma reaksiyonları gibi birçok temel fonksiyondan sorumludur1. Bununla birlikte, sert doku ile çevrili diş pulpası, derin çürükler, pulpitis, travma veya sonraki tedavilerden kaynaklanan yaralanmalara ve hasarlara karşı hassastır 2,3. Fonksiyonel diş pulpasının olmaması diş kırılganlığı riskini artırır4. Ayrıca, genç kalıcı dişlerde pulpa canlılığının kaybı diş olgunlaşmasını olumsuz etkileyebilir ve mevcut protez teknikleri, sağlıklı pulpanın sunduğu nöral geri bildirimi geri kazandırmakta başarısız olur4. Bu durum, araştırmacıları iltihaplı posayı sadece çıkarmanın ötesinde yönetmek için alternatif çözümler keşfetmeye yöneltti.
2007 yılında Murray ve ark. rejeneratif endodontide doku mühendisliği uygulamasını başlatmış ve böylece pulpanın korunması ve rejenerasyonuna olan ilginin artmasına neden olmuştur5. Bununla birlikte, iltihaplı pulpa dokusu, hücrelerin enflamatuar hücreleri işe alan ve hücre nekrozu, pulpa canlılığının kaybı ve fonksiyonel iyileşmede komplikasyonlarla sonuçlanan IL-6 gibi enflamatuar faktörleri serbest bırakması nedeniyle bir zorluk teşkil eder 6,7. Bu nedenle, iltihabı ve buna bağlı hücre ölümünü anlamak, hayati pulpanın korunmasındaki ilerlemeler için çok önemlidir. İnflamasyon pulpasının moleküler biyolojisini in vivo veya in vitroolarak araştırmak için yapılmış bir dizi deney vardır 8,9. Her ne kadar 2D veya 3D hücre kültürleri gibi in vitro deneyler yıllardır geliştirilmiş ve olgunlaşmakta ve pulpa hücrelerinin enflamatuar faktörlere reaksiyonlarını test etmek için yaygın olarak kullanılsa da, bu deneyler pulpa dokusu ile sistemik bağışıklık sistemi arasındaki etkileşimi yansıtamamaktadır10. İncelenen fenomen, bağışıklık, vasküler ve sinir sistemi gibi diğer doku kökenli hücrelerden türetilirse, saf pulpa hücre kültürü bir çıkmaza yol açacaktır. Bu nedenle, in vivo deneyler çok gerekli ve referanslıdır.
Fareler, maliyet etkinlikleri, yüksek doğurganlıkları ve canlılıkları nedeniyle in vivo inflamasyon araştırmalarında giderek daha yaygın bir seçim haline gelmiştir. Bununla birlikte, fareler pulpitis modeli için kapsamlı bir protokol şu anda mevcut değildir ve bu bir referans olarak hizmet edebilir. Farelerin küçük boyutları ve stimülasyona karşı duyarlılıkları, deneysel prosedürler sırasında önemli zorluklar ortaya çıkarmaktadır. Fare ağzının derinliklerine gizlenmiş küçük dişleri gözlemlemek, laboratuvarlarda masaüstü mikroskopların daha yaygın olmasına rağmen, genellikle bir konsol mikroskobunun kullanılmasını gerektirir. Ağız açıcının olmaması başkalarının yardımını gerektirir. Bunu ele almak için grup, fare pulpitis modelini oluşturmak için standartlaştırılmış ve tekrarlanabilir bir protokol sağlamayı amaçlayan, hazır malzemeleri kullanarak bir ağız tıkaç tasarladı. Bu makale, C57 farelerinde preoperatif hazırlık, immobilizasyon, pulpa maruziyet cerrahisi ve numune toplamayı kapsayan prosedürü detaylandırmaktadır. Bu protokol, diğer araştırmacıların prosedürü tekrarlamasını kolaylaştırmak için yapısı, üretimi ve uygulaması hakkında bilgi sağlayarak ağız tıkaçının kullanılmasını önerir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Bu çalışmadaki deneysel prosedürler, Sichuan Üniversitesi Batı Çin Stomatoloji Okulu etik komitesi tarafından onaylanmıştır (WCHSIRB-D-2021-125). Yetişkin C57BL / 6 fareleri, Gempharmatech Deney Hayvanları Şirketi, Chengdu, Çin'den elde edildi. Maksiller birinci azı dişinin tüm tacı doğumdan 21 gün sonra patlar. Ameliyat için fareler normal canlılık ile 21 günden daha eski olmalıdır11. Burada, modelleme için 6 ila 8 haftalık fareler kullanıldı. Şekil 1 , kullanılan protokolü gösteren bir akış diyagramıdır.
1. Ameliyat öncesi hazırlık (Şekil 2)
- Aşağıdaki aletleri edinin: Stereoskopik mikroskop, sabitleme plakası, tıbbi bant, ağız tıkacı, 0,6 mm çapında minimal invaziv diş çapağı, dental yüksek hızlı diş el aleti, 8 # C + dosyası, ısıtma yastığı, 1 mL şırınga, steril pamuk topu, göz forseps.
- Aşağıdaki ilaçları edinin: anestezi karışımı, veteriner merhemi.
2. Ağız tıkacının hazırlanması
- Fareyi 0.007 mL / g vücut ağırlığında anestezi karışımı çözeltisinin (% 10 ketamin hidroklorür +% 5 ksilazin +% 85 steril izotonik salin) intraperitoneal enjeksiyonu ile tartın ve uyuşturun ve ayak parmağı sıkıştırma yöntemiyle uygun anesteziyi onaylayın. Çalışma sırasında kurumaya bağlı olarak gözlerin yaralanmasını önlemek için gözlere oftalmik kayganlaştırıcı merhem sürün.
NOT: Tıbbi şapkalar, maskeler, eldivenler ve tulumlar ve diğer temel koruma gereklidir. Hem ameliyat ortamının hem de fare odasının temiz ve güvenli olduğundan emin olun. Prosedür boyunca termal destek için bir ısı yastığı gereklidir. - Ağız tıkacını aşağıda açıklandığı gibi hazırlayın (Şekil 3).
- Aşağıdaki malzemeleri edinin: 8 μm çapında ortodontik ark teli, genç halka bükme pensesi, ağır tel kesici, işaretleyici kalem, 3 mm uzunluğunda ve 1 mm kesit çapında lastik kapak.
- İlk olarak, sabitleme için ark telini sol elinizle düzeltin ve başparmağınızı düzeltin, sağ elin işaret parmağı telin yayına doğru hafifçe bükün. Bu işlemi birkaç kez tekrarlayın, doğru üç boyutlu Açıya bükülmeyi kolaylaştıracaktır.
- Yay telinin orta noktasında yaklaşık 8 mm uzunluğundaki yamuğun (Şekil 3C, a-lk-b) üst kenarını (Şekil 3G, a-i) bükmek için Yong halka bükme pensesini kullanın. A noktasının (Şekil 3) pense gagasının kenarında olduğundan emin olun.
- Penseyi sol elinizle tutun, yay telinin serbest ucunu sağ başparmağınız ve işaret parmağınızla sıkıştırın ve yaklaşık 120°'lik bir açı yapmak için yay telini a noktasından bükün. i noktasındaki önceki eylemi çoğaltın (Şekil 3G). Ark telinin meraklı olmadan yatay bir masaya koyarak bir düzlemde olup olmadığını kontrol edin.
- Her iki tarafta yaklaşık 9 mm uzunluk bırakın (Şekil 3D, a-b, l-k) ve her bir kenarın bir düzlem üzerinde olduğundan emin olurken, adım 2.2.4 ile aynı beceriyi kullanarak serbest ucu 75°'lik bir açıyla bükün. Bu keskin açıyı pense gagasının ucuyla bükün.
- b noktasından yaklaşık 5 mm uzaklıktaki c noktasını bulun. C noktasında 105°'lik bir açı bükmek için aynı beceriyi izleyin. c noktasından 105 mm d noktasında 5° açı daha bükün. D noktasından yaklaşık 4,5 mm bırakın ve e noktasını bulun. Yaklaşık 100 -105°'lik bir açı oluşturmak için serbest ucu e noktasında bükün (Şekil 3E).
NOT: Kullandığımız 6-8 haftalık C57 fareleri yaklaşık 20 g idi. 5 mm'lik aralık sadece farelerin üst ve alt çenelerini hareket etmeden sıkıştırmakla kalmaz, aynı zamanda farelerin cildine baskı yapmaz ve rahatsızlığa neden olmaz. Başka türler veya yaşlardaki fareler kullanılıyorsa, lütfen cd ve ih parçalarının uzunluğunu fiili duruma göre ayarlayın (Şekil 3E,G). - Mandibular kısım için fazladan bir dil bastırıcı bükün (Şekil 3G, j-i-h-g).
- a-b-c parçasının l-k-j parçasındaki çift büküm adımları. I-k ve kj parçalarını aynı anda sıkıştırın ve serbest ucu j noktasında bükün ve i-k-j düzlemine dikey hale getirin. J noktasından 5 mm uzakta olan kenetlenme noktası i, serbest ucu hem i-k-j düzlemine hem de c-d kısmına paralel olacak şekilde bükün (Şekil 3H).
- İ noktasından 5 mm uzunluk bırakın, h noktasında kemeri i-h kısmına dikey ve j-i-h düzlemine paralel olarak bükün. H noktasından 5 mm'de g noktasını bulun. JIHG düzlemini sıkıştırın ve serbest ucu kj kısmına simetrik olarak bükün. Daha sonra f noktasından sonraki serbest uç, e-serbest uç noktasına simetrik olmalıdır (Şekil 3H).
- Serbest uca lastik kapaklar yerleştirin (Şekil 3F).
3. İmmobilizasyon
- Fareyi sırt üstüne, deri bandı ile sabitlenmiş uzuvlarla sabitleme plakasına sabitleyin. Ağız tıkacının serbest uçlarını başparmak ve işaret parmağınızla sıkıştırın.
- Farenin ön kesici dişlerini iki kolun yamuk oluğuna sabitleyin. Dil bastırıcılı kolun mandibula için olduğundan emin olun. Farenin dilinin hareketsiz olduğundan ancak iskemik olmadığından emin olmak için ağız tıkacını ayarlayın.
4. Diş değerlendirmesi
- Ameliyat için maksiller birinci azı dişinin diş çürüğü, travma ve odontogenez içermediğinden emin olun. Çevredeki diş etinde kızarıklık, şişlik veya fistül olmadığından emin olun. Karşı dişlerin sağlıklı olduğundan ve sağlıklı kontrol grubu olarak hareket etmeye hazır olduğundan emin olun.
5. Kağıt hamuru maruziyeti
- Maksiller birinci azı dişinin oklüzal tarafında 20.000 rpm hızında delmek için diş çapağı kullanın. Emayenin çıkarıldığından emin olun. Diş pulpa dokusu üzerinde aşırı termal stimülasyonu önlemek için dental el aleti ile işlemi sadece sığ dentin tabakasında tutun12.
- Aynı zamanda, operasyon sırasında her 3 dakikada bir diş üzerine normal salin damlatmak için bir şırınga kullanarak aşırı ısınmayı önleyin.
- Delinmiş çukurun en alt konumuna 8 # veya 10 # C + eğesi koyun ve pulpa odasını ortaya çıkarmak için son dentini delin. Lokal dentin tamamen çıkarıldığında belirgin bir düşme hissi olacaktır. Çok derine inmeyin, aksi takdirde diş pulpa dokusu pulpa odasından dışarı çıkarılabilir.
- Dişin etrafındaki parçaları temizleyin. Ağız tıkacını çıkarın; Ameliyat bitti. Karşı maksiller birinci azı dişini işlem yapmadan kontrol olarak kullanın.
6. Ameliyat sonrası bakım
- Ameliyattan sonra, carprofen'i (5 mg / kg) deri altına uygulayın ve fareyi anesteziden iyileşene kadar yüzüstü pozisyonda kemotermal ısıtma yastığının üzerine yerleştirin. Fareleri besleyin ve içme suyu sağlayın. Kurtarma süreci denetlenmelidir. Fare tamamen iyileşene kadar aynı odada başka hiçbir hayvan bulunmamalıdır.
7. Numune toplama ve saklama
- Deney9'a göre, operasyondan 24 saat sonra veya başka bir zaman noktasında derin anestezik koşul altında servikal çıkık olan fareyi ötenazi yapın. Maksilla ve zigomaya bağlı iskelet kaslarını oftalmik makasla kesin. İskeleti, ön kemiği ve yumuşak dokuyu çıkarın ve maksiller azı dişleri ile lamina gnathostegite'yi çıkarın.
NOT: He ve arkadaşlarına göre, diş pulpası dokusunda geniş nekrozu önlemek için pulpitis örneğinin ameliyattan 72 saatten daha kısa bir süre sonra toplanması gerektiği takdir edilmektedir13. - Gnathostegite'i sagittal olarak ikiye bölün ve dokuyu 24 saat fiksasyon için 4 ° C'de PBS, pH 7.4'te% 4 paraformaldehit içinde saklayın.
8. Histolojik analiz
- Dokuyu fosfat tamponlu salin (PBS) ile yıkayın ve PBS, pH 7.4'te pH 7.4'te 2-4 hafta boyunca 4 ° C'de% 5 EDTA ve% 4 sükrozdan oluşan günlük değiştirilmiş dekalsifikasyon solüsyonunda kireçten arındırın10.
- 1/2 gnathostegite'yi parafine gömün ve dişsiz sagital yüzün doku kasetlerinin dibinde olduğundan emin olun.
- Parafin bloğunu bir parafin mikrotomu ile 5 μm kalınlığında dilimler halinde kesin. Parafin bloğunun açısını, mikroskop altında gözlemlenen proksimal, distal, üst ve alt ilişkiye göre ayarlayın, böylece tam taç hamurunun ve birinci azı dişinin perforasyonunun kesilebilmesini sağlayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Yukarıda tarif edilen işlem 3, 6-8 haftalık C57BL/6 farelerin sağ maksiller birinci azı dişlerine uygulanırken, sol maksiller birinci azı dişleri kontrol olarak korundu. Boş kontrolden elde edilen histoloji ve immünofloresan sonuçları, 12 saat pulpitis ve 24 saat pulpitis örnekleri gösterim için kullanıldı.
Goldman ve ark.15'ten alınan BT analizi protokolünü takiben, pulpa maruziyeti Şekil 4 A-C'de mikro-BT ve rekonstrüksiyon modellemesi ile doğrulandı. Maksiller birinci azı dişlerinin hem kontrol hem de cerrahi açıdan sagital kesitlerine HE boyandı (Şekil 5). Pulpa doku nekrozu ve yara kenarında hücre morfolojisi parçalanması gösterildi. Nekroz esas olarak perforasyonun yakınındaki pulpa dokusunda yoğunlaşmıştı ve açılmamış taraftaki pulpa dokusunun şekli normaldi. 24 saatte, kök pulpası da dahil olmak üzere pulpa dokularının çoğu morfolojik olarak sağlamdı. (Şekil 5).
IL-614'ün ekspresyonu kontrolde düşüktü ve 12 saatte yara çevresinde az miktarda IL-6 gözlenebilirken, IL-6'nın ekspresyonu 24 saatte önemli ölçüde artmıştı. Ayrıca, IL-6'nın ekspresyonu esas olarak yara kenarında ve orta pulpa boynuzunda yoğunlaşmıştır (Şekil 6). Şekil 6 D,E'de, IL-6+ diş pulpası hücrelerinin sayısı ve IL-6+ hücrelerinin toplam diş pulpası hücrelerine oranı üç zaman noktasında zamanla artar. Pulpa maruziyetinden sonra bölgenin yavaş yavaş iltihaplanma geliştirdiği ve ağırlaştığı düşünülebilir.
C57 farelerinin maksiller dişleri üzerinde hiç ameliyat yapmamış 5 meslektaşımızı, farenin üst ve alt çenesini hareketsiz hale getirmek için gereken süreyi hesaplamaya (Aşama 1) ve farenin üst ve birinci azı dişini (Aşama 2) geleneksel prosedürü izleyerek iki lastik bantla Goldman ve arkadaşları tarafından yayınlanan protokole veya ağız tıkaç15 ile olan protokolümüzü açıklamaya davet ettik. Matkabın mikroskop altında farenin maksiller birinci azı dişine doğru şekilde yerleştirilmesi için gereken süre de analiz için hesaplandı. Şekil 3 J,K'deki sonuçlar, farelerde ağız fiksasyonu ve ağız-tıkaçlı maksiller birinci azı dişi bulma süresinin geleneksel yönteme göre anlamlı derecede kısaldığını göstermiştir (P<0.05). Ağız tıkaç kullanımı, operasyon verimliliğini artırabilir ve operasyon zorluğunu azaltabilir.
Şekil 1: Hamur maruziyet prosedürünün akış diyagramı. (A) Ağız tıkaç ile fiksasyondan sonra, farenin maksiller birinci azı dişi mikroskop altında tamamen açığa çıkarılmalıdır. (B) Birinci azı dişinin oklüzal minesini ve yüzeysel dentinini çıkarmak için minimal invaziv diş çapağı olan yüksek hızlı bir diş aleti kullanın, ancak aşırı ısınmanın neden olduğu pulpa üzerinde aşırı etkiyi önlemek için dentine doğrudan nüfuz etmemeye dikkat edin. (C) Kalan dentine nüfuz etmek ve pulpayı ortaya çıkarmak için 8# C+ törpüsü kullanın. (D) Örnekler ameliyattan 24 saat sonra toplandı. HE ve immünofloresan boyama, bu zaman noktasında bir pulpitis modelinin kurulabileceğini kanıtladı. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Hamur maruziyet prosedürü için ekipman. (A) Stereoskopik mikroskop ve dental yüksek hızlı dental el aletinin motoru. (B) 8 # C + dosyası, minimal invaziv diş çapağı, ağız tıkacı, cımbız ve diş yüksek hızlı diş aleti. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Ağız tıkacının yapılması. (A) Ağız tıkacının iki çalışma kolu yapmak için teli bükün. (İ.Ö.) Mandibula için dil spatula bükme adımları. (D-E) Maksilla için dil spatulası yok. (F, H) Yaralanmanın delinmesini önlemek için lastik kapaklar veya bükülmüş uçlar gereklidir. (G) Referans için ağız tıkacının üç görünümü. (I) Ağız tıkaçının klinik kullanımı. (J) Yeni başlayanlar için sırasıyla geleneksel fiksasyon yöntemi ve ağız tıkaç kullanarak üst ve alt çeneleri (Aşama 1) sabitlemek için ortalama süre. (K) Yeni başlayanlar için sırasıyla geleneksel fiksasyon yöntemi ve ağız tıkaç kullanarak maksiller birinci azı dişini (Aşama 2) net bir şekilde bulmaları için ortalama süre. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: Kırmızı noktalı çizgi ile işaretlenmiş perforasyonlu ameliyatlı fist molar'ın mikro-BT analizi. (A) Dişin sagital düzlemi, pulpa odası tabanında herhangi bir perforasyon olmadığından emin olun. (B) Koronal düzlem. (A)'daki perforasyona karşılık gelen, kırmızı noktalı çizgi ile daire içine alınmış mine dentininin tam penetrasyonu gözlenebilir. (C) CT rekonstrüksiyon modelinin oklüzal düzlemi. Kırmızı noktalı çizgi ile daire içine alınmış perforasyonun yeri daha sezgisel bir şekilde teyit edilir ve hamur odasının tabanı perforasyon yoluyla gözlemlenebilir. (D-G) Tedavinin intraoperatif fotoğrafları. (D) Boşluk veya malformasyon olmadığından emin olmak için farenin maksiller birinci azı dişini kontrol edin. (E) Diş minesini ve sığ dentini çıkarmak için minimal invaziv bir çapak kullanmak. Görüntüde görüldüğü gibi, dişin oklüzal yüzünde perforasyon olmaksızın bir çukur (kesikli beyaz çizgi ile daire içine alınmış) görülebilir. (F) Kalan dentine nüfuz etmek için 8 # C + eğe kullanarak, eğe el desteği olmadan dişe sıkışabilir. (G) Eğe çıkarıldığında, dişin başarılı pulpa maruziyetini gösteren pembe bir perforasyonu vardır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 5: Hematoksilen-eozin boyama. (A) Kontrol için tedavi edilmemiş birinci azı dişinin bütünsel görünümü. (Cevap-1,2,3) Panel (A)'da 1, 2, 3'e karşılık gelen yüksek büyütme rakamları. 3 pozisyonda diş pulpası dokusunun şekli sağlamdı ve odontoblastlar düzenli bir düzendeydi. (B) Ameliyattan 12 saat sonra dişlerin bütünsel görünümü. (B-1,2,3) Panel (B)'de 1, 2, 3'e karşılık gelen yüksek büyütme rakamları. 1. ve 2. pozisyondaki diş pulpa dokusunun şekli genellikle sağlamdı. Perforasyonun yakınında nekroz gözlenebilir. (C) Ameliyattan 24 saat sonra dişlerin bütünsel görünümü. (C-1,2,3) Panel (C)'de 1, 2, 3'e karşılık gelen yüksek büyütme rakamları. Nekroz, tek bir pulpa boynuzundan yakındaki pulpa dokusuna kadar uzanır. Ancak kök pulpası da dahil olmak üzere pulpa dokularının çoğu morfolojik olarak sağlamdır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 6: İmmünofloresan boyama. (A) Kontrol için tedavi edilmemiş birinci azı dişinin bütünsel görünümü. (Cevap-1,2,3) Panel (A)'da 1, 2, 3'e karşılık gelen yüksek büyütme rakamları. Neredeyse hiç IL-6 ekspresyonu gözlenmedi. (B) Ameliyattan 12 saat sonra dişlerin bütünsel görünümü. (B-1, 2, 3) Panel (B)'de 1, 2, 3'e karşılık gelen yüksek büyütme rakamları. B-3'te gösterilen perforasyonun yakınındaki dokuda konsantre olan IL-6'nın arttırılması. B-1,2'de belirgin bir değişiklik gözlenmedi. (C) Ameliyattan 24 saat sonra dişlerin bütünsel görünümü. (C-1, 2, 3) Panel (C)'de 1, 2, 3'e karşılık gelen yüksek büyütme rakamları. IL-6 ekspresyonu C-2,3'te önemli ölçüde artmıştır. (D) Kontroldeki toplam IL-6+ diş pulpası hücresi miktarı, 12 saat pulpa maruziyeti, 24 saat pulpa maruziyeti immünofloresan boyama sonuçları. (E) IL-6+ hücrelerinin kontroldeki toplam pulpa hücresi miktarına oranı, 12 saat pulpa maruziyeti, 24 saat pulpa maruziyeti immünofloresan boyama sonuçları. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dişlerin içindeki tek yumuşak doku olan diş pulpası, dişin biyoaktivitesinin korunmasında çok önemli bir rol oynar, ancak oldukça hassas kalır. Bu hayati pulpanın korunması, son endodontik tedavilerde tercih edilen ilk yaklaşım haline gelmiştir ve dental pulpanın enflamatuar mekanizmalarının kapsamlı bir şekilde anlaşılmasını gerektirmiştir16. İnflamatuar mikroçevrenin uzay-zamansal dalgalanması ve pulpitiste yerleşik hücre tipleri arasındaki etkileşimler, in vitro çalışmalar yoluyla araştırmasını zorlaştırmaktadır11. Bunun yerine, in vivo çalışmalar, insanlarda bulunan fizyolojik ortamı çoğaltarak faydalar sunar. Deneysel farelerin, özellikle aşırı eksprese edilmiş veya devrilmiş genlere sahip olanların kullanılması, hipotez doğrulaması için etkili bir araç sağlar. Bununla birlikte, laboratuvarlarda sıklıkla kullanılan C57 fareleri, küçük boyutları ve koordinasyon eksikliği nedeniyle zorluklar yaratmakta ve uyaranların dişlerine uygulanmasını sorunlu hale getirmektedir17. Bu sorunu ele almak için, araştırmacılara farelerin ağız boşlukları içinde prosedürleri gerçekleştirmelerinde yardımcı olmak için yeni ağız tıkacının kapsamlı bir açıklamasına ihtiyaç vardır. Ayrıca, bu makale, ağız tıkaç kullanılarak farelerin ilk azı dişine pulpa maruziyeti yoluyla bir pulpitis modeli oluşturma protokolünü özetlemekte ve böylece sonraki araştırmalar için değerli bir rehber sunmaktadır.
Çok sayıda yinelemeden sonra, yapımı kolay, ölçeklenebilir bir ağız tıkaç başarıyla tasarlandı. Ağız tıkacının boyutları ve üç görünümlü şeması Şekil 3'te verilmiştir. Protokol, bir yay yerine trapez bir tasarım benimseyerek tel bükme işlemini önemli ölçüde basitleştirdi. Ağız tıkacı, farenin ağzından kaymayı önleme ihtiyacını dengeleyen ve yeterli açma kuvveti sağlayan 0,8 mm çapında bir ortodontik ark teli kullanır. Ayrıca, ortodontik ark telinin elastikiyeti, farelerin temporomandibular eklemini korur. Ağız tıkaç kompakttır, korozyona karşı dayanıklıdır ve tekrar tekrar kullanım için alkollü 50 mL'lik bir santrifüj tüpünde saklanabilir. Bir farenin ısırma basıncına rağmen, ağız tıkacı ağızda sabit kalır ve araştırmacıların mikroskop altında yardımsız çalışmasına izin verir. Ağız tıkacının boyutunun farklı fare vücut boyutlarına uyacak şekilde ayarlanabileceğine dikkat edilmelidir. Ağız farenin sınırının ötesine gerilirse, temporomandibular eklem (TMD) veya maksillofasiyal kasların yaralanmasını önlemek için ağız tıkacı derhal çıkarılmalıdır.
O ve ark.'nın raporu, nekrozun pulpa maruziyetinden 24 saat sonra tespit edilebileceğini ve pulpa dokusunun çoğunluğunun 72 saat18 sonra nekrotik hale geldiğini göstermektedir. Bu nedenle, aşırı ölü hücreler nedeniyle geçersiz deneysel sonuçlardan kaçınmak için pulpa dokusunun bu 72 saatlik pencere içinde toplanması önemlidir. C+ törpüsünü pulpa haznesine yerleştirirken, pulpa dokusunun aşırı hasar görmesini önlemek için tekrarlanan döndürme ve derin itmeden kaçınılmalıdır. İşlem sırasında yoğun kanama meydana gelirse, öksürüğü önlemek için küçük bir pamuk kullanarak kanın nazikçe alınması önerilir. Her iki tarafta aynı anda modellemenin model doğruluğu üzerindeki potansiyel olumsuz etkisi nedeniyle işlem fare maksillasının yalnızca bir tarafında yapılmalıdır, bu da diyet alımı komplikasyonlarına neden olabilir. Ameliyat sonrası, farelere anti-enflamatuar ilaçlar veya antibiyotikler verilmemesi tavsiye edilir.
Ağız tıkaçları, farenin ağzını açık tutmada etkili olsa da, cerrahi bölge ile ilgili sınırlamalara sahiptir. Dil bastırıcı ile bastırılan dil tarafından korunan mandibular arka dişler genellikle net bir şekilde görülemez. Bu nedenle işlem sadece üst çene dişleri veya mandibular ön dişler üzerindeki operasyonlar için uygundur. Ameliyat 20 dakikayı aşarsa, ağız tıkacının stabilitesi farelerin oklüzal kuvvetini antagonize etmeye bağlı olduğundan, fareye her 10 dakikada bir ara verilmesi önerilir. Hızlı üremeleri ve bulunabilirlikleri nedeniyle seçilen C57 fareleri, çeşitli uyaranlara karşı hassastır; Bu nedenle, hafif bir aşırı dozda ilaç veya uyaran öldürücü olabilir. Ayrıca, dişlerinin küçük boyutu, doku dilimleme için daha yüksek bir beceri seviyesi gerektirir.
Sonuç olarak, pulpa iltihabı ve nekrozu, pulpa rejenerasyonunda acil zorlukları temsil etmektedir. Bu çalışma, enflamatuar faktörleri doğrulayan immünofloresan sonuçları ile farelerde bir pulpitis modeli oluşturmanın kapsamlı bir gösterimini sunmaktadır. Bu makale, dil müdahalesi olmadan farenin ağzını açık tutarak operatöre engelsiz görüş sağlayan yeni, kullanışlı bir ağız tıkaç tasarımı önermektedir. Bununla birlikte, mandibular arka dişlerdeki operasyonlar hala bir zorluk olmaya devam etmektedir. Deneysel farelerin kullanılmasının avantajları göz önüne alındığında, farelerde endodontik modelleme önemli bir umut vaat etmektedir ve teknik eşikte daha fazla azalma öngörülmesi planlanmaktadır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar herhangi bir çıkar çatışması beyan etmezler.
Acknowledgments
Bu çalışma, Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı U21A20368 (LY), 82101000 (HW) ve 82100982 (FL) ve Sichuan Bilim ve Teknoloji Programı 2023NSFSC1499 (HW) tarafından sağlanan hibelerle finanse edilmiştir. Tüm orijinal veriler ve görüntüler bu belgeye dahil edilmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Animal | |||
| C57/B6J mice | Gempharmatech Experimental Animals Company | C57/B6J | For the establishment of pulp exposure |
| Equipment | |||
| 1 mL syringe | Chengdu Xinjin Shifeng Medical Apparatus & Instruments Co. LTD. | SB1-074(IV) | Apply in drug injection. |
| 8# C+ file | Readysteel | 0010047 | Apply in exposing the roof of pulp chamber. |
| Anesthesia Mix solution | 10% ketamine hydrochloride+ 5% xylazine + 85% sterile isotonic saline. | ||
| DAPI Staining Solution | Beyotime | C1005 | Apply in immunofluorescence staining for counter-staining of nucleus. |
| Dental high-speed dental handpiece | Jing yuan electronic commerce technology | WJ-422 | Apply in pulp exposure. |
| Heavy wire cutter | Jirui Medical Instrument Co., Ltd. | none | Apply inarc cutting. |
| Hematoxylin and Eosin Stain kit | Biosharp | BL700B | For the histological analysis of the slides. |
| IL-6 antibody | Novus | NBP2-89149 | Apply in immunofluorescence staining to detect the inflammation of the dental pulp. |
| Ketamine(Ketamine hydrochloride) | Vet One, Boise, Idaho, USA | C3N VT1 | 100mg/kg, IP. Apply in nesthetization. |
| Medical tap | 3M | 1530 | Apply in mice immobilization. |
| Orthodontic arch wire | Shanghai Wei Rong Medical Apparatus Co. LTD. | K417 | Diameter of 8µm |
| Round dental burr (0.6 mm) | Shofu global | 072208 | Apply in removing enamel and shallow layer of dentin. |
| Young loop bending plier | Jirui Medical Instrument Co., Ltd. | none | Apply in arc bending. |
References
- Kleinert, A., Kleinert, L., Ozimirska, M., Chałas, R. Endodontium - together or separately. Folia Morphol. 77 (3), 409-415 (2018).
- Dhillon, H., Kaushik, M., Sharma, R.
- Prati, C., Pirani, C., Zamparini, F., Gatto, M. R., Gandolfi, M. G. A 20-year historical prospective cohort study of root canal treatments. A Multilevel analysis. Int Endod J. 51 (9), 955-968 (2018).
- Su, Y., Wang, C., Ye, L. Healing rate and post-obturation pain of single- versus multiple-visit endodontic treatment for infected root canals: a systematic review. J Endod. 37 (2), 125-132 (2011).
- Murray, P. E., Garcia-Godoy, F., Hargreaves, K. M. Regenerative endodontics: a review of current status and a call for action. J Endod. 33 (4), 377-390 (2007).
- Arora, S., et al. Potential application of immunotherapy for modulation of pulp inflammation: opportunities for vital pulp treatment. Int Endod J. 54 (8), 1263-1274 (2021).
- Eramo, S., Natali, A., Pinna, R., Milia, E. Dental pulp regeneration via cell homing. Int Endod J. 51 (4), 405-419 (2018).
- Hasan, A., et al. Expression of Toll-like receptor 2, Dectin-1, and Osteopontin in murine model of pulpitis. Clin Oral Investig. 27 (3), 1177-1192 (2023).
- Wang, Y., et al. DDIT3 aggravates pulpitis by modulating M1 polarization through EGR1 in macrophages. Int Immunopharmacol. 120, 110328 (2023).
- Richert, R., et al. A critical analysis of research methods and experimental models to study pulpitis. Int Endod J. 55 (Suppl 1), 14-36 (2022).
- Huang, X. F., Zhao, Y. B., Zhang, F. M., Han, P. Y. Comparative study of gene expression during tooth eruption and orthodontic tooth movement in mice. Oral Dis. 15 (8), 573-579 (2009).
- Kwon, S. J., et al. Thermal irritation of teeth during dental treatment procedures. Restor Dent Endod. 38 (3), 105-112 (2013).
- He, Y., et al. Pulpal tissue inflammatory reactions after experimental pulpal exposure in mice. J Endod. 43 (1), 90-95 (2017).
- Karrar, R. N., et al. Molecular biomarkers for objective assessment of symptomatic pulpitis: A systematic review and meta-analysis. Int Endod J. 56 (10), 1160-1177 (2023).
- Goldman, E., Reich, E., Abramovitz, I., Klutstein, M.
- Duncan, H. F. Present status and future directions-Vital pulp treatment and pulp preservation strategies. Int Endod J. 55 (Suppl 3), 497-511 (2022).
- Shi, X., Li, Z., He, Y., Jiang, Q., Yang, X. Effect of different dental burs for experimental induction of pulpitis in mice. Arch Oral Biol. 83, 252-257 (2017).
- Du, W., et al. Indigenous microbiota protects development of medication-related osteonecrosis induced by periapical disease in mice. Int J Oral Sci. 14 (1), 16 (2022).
