Summary
В данной статье представлен оптимизированный протокол установления модели пульпита у мышей с использованием инновационного ротового кляпа с последующим гистологическим анализом.
Abstract
Пульпит, распространенная причина естественной потери зубов, приводит к некрозу и потере биологической активности в воспаленной пульпе зуба. Разгадка механизмов, лежащих в основе пульпита, и его эффективное лечение находятся в центре внимания эндодонтических исследований. Таким образом, понимание воспалительного процесса в пульпе зуба жизненно важно для улучшения сохранности пульпы. По сравнению с другими экспериментами in vitro , модель пульпита у мышей предлагает более достоверный и генетически разнообразный контекст для наблюдения за патологическим прогрессированием пульпита. Тем не менее, использование мышей, несмотря на их экономическую эффективность и доступность, создает трудности из-за их небольшого размера, плохой координации и низкой переносимости, что усложняет внутриротовые и стоматологические процедуры. Этот протокол представляет собой новую конструкцию и применение кляпа для обнажения пульпы мыши, способствуя более эффективным внутриротовым процедурам. Кляп, состоящий из зубной дуги, легко доступной для большинства стоматологов, может значительно ускорить хирургическую подготовку даже к первым процедурам. Для выявления изменений морфологии и экспрессии клеток использовали микрокомпьютерную томографию, окрашивание гематоксилин-эозином (ПЭ) и иммунофлуоресцентное окрашивание. Цель данной статьи – помочь исследователям разработать более воспроизводимую и менее сложную процедуру создания модели воспаления пульпы с использованием этого нового кляпа.
Introduction
Пульпа зуба, неотъемлемая часть зуба, отвечает за множество важных функций, таких как снабжение питательными веществами, образование дентина, сенсорная функция и защитные реакции1. Тем не менее, пульпа зуба, окруженная твердыми тканями, подвержена повреждениям и повреждениям в результате глубокого кариеса, пульпита, травмы или последующих методов лечения 2,3. Отсутствие функциональной пульпы зуба увеличивает риск хрупкости зубов4. Кроме того, потеря жизнеспособности пульпы в молодых постоянных зубах может негативно сказаться на созревании зубов, а современные методы протезирования не могут восстановить нервную обратную связь, обеспечиваемую здоровой пульпой4. Эта ситуация заставила исследователей изучить альтернативные решения для борьбы с воспаленной пульзой, помимо простого удаления.
В 2007 году Мюррей и др. инициировали применение тканевой инженерии в регенеративной эндодонтии, тем самым вызвав повышенный интерес к сохранению и регенерации пульпы5. Тем не менее, воспаленная ткань пульпы представляет собой проблему, поскольку клетки выделяют воспалительные факторы, такие как IL-6, которые рекрутируют воспалительные клетки и приводят к некрозу клеток, потере жизнеспособности пульпы и осложнениям в функциональном восстановлении 6,7. Таким образом, понимание воспаления и связанной с ним гибели клеток имеет решающее значение для прогресса в сохранении жизненно важной пульпы. Существует ряд экспериментов, которые были проведены для изучения молекулярной биологии воспламененной пульпы in vivo или in vitro 8,9. Несмотря на то, что эксперименты in vitro, такие как 2D или 3D клеточные культуры, разрабатываются в течение многих лет и становятся все более зрелыми и широко используются для проверки реакций клеток пульпы на воспалительные факторы, эти эксперименты не могут отразить взаимодействие между тканью пульпы и системнойиммунной системой. Если изучаемое явление получено из клеток другого тканевого происхождения, таких как иммунная, сосудистая и нервная системы, то культура клеток чистой пульпы приведет к тупику. Поэтому эксперименты in vivo очень нужны и референтны.
Мыши все чаще становятся распространенным выбором в исследованиях воспаления in vivo из-за их экономической эффективности, высокой фертильности и жизнеспособности. Тем не менее, в настоящее время отсутствует комплексный протокол для модели пульпита мышей, который мог бы служить эталоном. Небольшие размеры мышей и их чувствительность к стимуляции создают значительные проблемы во время экспериментальных процедур. Наблюдение за крошечными зубами, скрытыми глубоко во рту мыши, часто требует использования консольного микроскопа, несмотря на более распространенное присутствие настольных микроскопов в лабораториях. Отсутствие открывателя рта требует помощи со стороны окружающих. Чтобы решить эту проблему, группа разработала кляп для рта с использованием легкодоступных материалов, целью которого является обеспечение стандартизированного и воспроизводимого протокола для построения модели пульпита мышей. В этой статье подробно описана процедура, охватывающая предоперационную подготовку, иммобилизацию, операцию по экспозиции пульпы и сбор образцов у мышей C57. Этот протокол рекомендует использовать кляп для рта, предоставляя информацию о его структуре, производстве и применении, чтобы облегчить другим исследователям воспроизведение процедуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Экспериментальные процедуры в этом исследовании были одобрены этическим комитетом Западно-Китайской школы стоматологии Сычуаньского университета (WCHSIRB-D-2021-125). Взрослые мыши C57BL/6 были получены от компании Gempharmatech Experimental Animals Company, Чэнду, Китай. Вся коронка первого моляра верхней челюсти прорезывается через 21 день после рождения. Мыши для операции должны быть старше 21 дня при нормальной жизнеспособности11. Здесь для моделирования использовались мыши в возрасте от 6 до 8 недель. На рисунке 1 показана блок-схема, показывающая используемый протокол.
1. Предоперационная подготовка (Рисунок 2)
- Приобретите следующие инструменты: Стереоскопический микроскоп, фиксирующую пластину, медицинскую ленту, рот-кляп, малоинвазивный зубной бор диаметром 0,6 мм, стоматологический высокоскоростной стоматологический наконечник, пилку 8#C+, грелку, шприц объемом 1 мл, стерильный ватный тампон, глазные щипцы.
- Приобретают следующие препараты: смесь для анестезии, ветеринарную мазь.
2. Приготовление рта-кляпа
- Взвесьте и обезболите мышь путем внутрибрюшинного введения раствора анестезиологической смеси (10% кетамина гидрохлорид + 5% ксилазин + 85% стерильный изотонический раствор) в дозе 0,007 мл/г массы тела и подтвердите надлежащую анестезию методом щипкового пальца ноги. Нанесите на глаза офтальмологическую смазывающую мазь, чтобы предотвратить травмирование глаз из-за высыхания во время операции.
ПРИМЕЧАНИЕ: Необходимы медицинские шапки, маски, перчатки и комбинезоны, а также другие средства индивидуальной защиты. Убедитесь, что операционная среда и мышиная камера чистые и безопасные. Грелка для термоподдержки на протяжении всей процедуры необходима. - Приготовьте кляп для рта, как описано ниже (Рисунок 3).
- Приобретите следующие материалы: ортодонтическую дуговую проволоку диаметром 8 мкм, молодые плоскогубцы для изгиба петли, тяжелый кусачок для проволоки, маркер, резиновый колпачок длиной 3 мм и диаметром сечения 1 мм.
- Сначала выпрямите арочную проволоку левой рукой для фиксации и большим пальцем, указательный палец правой руки слегка согните против дуги проволоки. Повторите это действие несколько раз, это облегчит изгиб до правильного трехмерного угла.
- С помощью плоскогубцев для изгиба петли Йонг согнуть верхний край (Рисунок 3G, a-i) трапеции (Рисунок 3C, a-l-k-b) длиной около 8 мм в средней точке носовой проволоки. Убедитесь, что точка a (рисунок 3) находится на краю клюва плоскогубцев.
- Держите плоскогубцы левой рукой, зажмите свободный конец носовой проволоки большим и указательным пальцами правой руки и согните луковую проволоку от точки А под углом около 120°. Продублируйте предыдущее действие в точке i (рисунок 3G). Проверьте, находится ли арочный провод на одной плоскости, положив его на горизонтальный стол без поддевания.
- Оставьте около 9 мм длины с каждой стороны (Рисунок 3D, a-b, l-k) и согните свободный конец под углом 75°, используя тот же навык, что и в шаге 2.2.4, при этом следя за тем, чтобы каждый край находился в одной плоскости. Загните этот острый угол кончиком плоскогубца клюва.
- Найдите точку c примерно в 5 мм от точки b. Следуйте тому же умению, чтобы согнуть угол 105° в точке c. Согните еще один угол 105° в точке d на 5 мм от точки c. Отойдите примерно на 4,5 мм от точки d и найдите точку e. Согните свободный конец в точке e так, чтобы образовался угол около 100-105° (Рисунок 3E).
ПРИМЕЧАНИЕ: У 6-8-недельных мышей C57, которых мы использовали, было около 20 г. Расстояние в 5 мм могло не только заклинивать верхние и нижние челюсти мышей, не двигаясь, но и не давило бы на кожу мышей и не вызывало бы дискомфорта. Если используются мыши других видов или возрастов, пожалуйста, отрегулируйте длину частей c-d и i-h в соответствии с фактической ситуацией (рис. 3E, G). - Согните дополнительный депрессор языка для нижней челюсти (Рисунок 3G, j-i-h-g).
- Повторите шаги гибки детали a-b-c на детали l-k-j. Зажмите детали i-k и k-j одновременно и согните свободный конец в точке j, чтобы он стал вертикальным по отношению к плоскости i-k-j. В точке зажима i, которая находится в 5 мм от точки j, согните свободный конец так, чтобы он был параллельен плоскости i-k-j и c-d части (Рисунок 3H).
- Оставьте 5 мм длины от точки i, в точке h согните арку вертикально к i-h части и параллельно плоскости j-i-h. Найдите точку g на расстоянии 5 мм от точки h. Зажмите плоскость j-i-h-g и согните свободный конец симметрично k-j части. Тогда свободный конец после точки f должен быть симметричен точке e-свободный конец (рисунок 3H).
- Наденьте резиновые колпачки на свободный конец (рисунок 3F).
3. Иммобилизация
- Зафиксируйте мышь лежа на фиксирующей пластине конечностями, закрепленными кожной лентой. Сожмите свободные концы рта-кляпа большим и указательным пальцами.
- Зафиксируйте передние резцы мыши в трапециевидной бороздке двух рук. Убедитесь, что рука с депрессором языка предназначена для нижней челюсти. Отрегулируйте кляп для рта, чтобы убедиться, что язык мыши обездвижен, но не ишемичен.
4. Оценка зубов
- Убедитесь, что первый моляр верхней челюсти для операции не должен иметь кариеса, травм и одонтогенеза. Убедитесь, что на окружающей десне нет покраснения, отека или свища. Убедитесь, что противоположные зубы здоровы и готовы выступать в качестве здоровой контрольной группы.
5. Воздействие пульпы
- Используйте зубной бор для сверления на окклюзионной стороне первого моляра верхней челюсти со скоростью 20 000 об/мин. Следите за тем, чтобы эмаль была удалена. Проводите операцию с помощью стоматологического наконечника только в неглубоком слое дентина, чтобы предотвратить чрезмерную термическую стимуляцию тканей пульпы зуба12.
- В то же время предотвратите перегрев, используя шприц, чтобы капать обычный физиологический раствор на зуб каждые 3 минуты во время операции.
- Поместите напильник 8# или 10# C+ на самое нижнее место просверленной ямы и проткните последний дентин, чтобы обнажить камеру пульпы. Это будет явное ощущение падения, когда будет тщательно удален местный дентин. Не копайте слишком глубоко, иначе ткань пульпы зуба может быть выведена из пульповой камеры.
- Очистите фрагменты вокруг зуба. Снимите кляп; Операция завершена. Используйте противоположный первый моляр верхней челюсти в качестве контрольного без операции.
6. Послеоперационный уход
- После операции введите карпрофен (5 мг/кг) подкожно и поместите мышь на хемотермическую грелку в положении лежа до восстановления после анестезии. Накормите мышей и обеспечьте питьевой водой. Процесс восстановления должен находиться под контролем. Никакие другие животные не должны находиться в той же камере до тех пор, пока мышь полностью не выздоровеет.
7. Сбор и хранение проб
- Усыпить мышь с вывихом шейки матки под глубокой анестезией через 24 ч после операции или в любой другой момент времени согласно эксперименту9. Разрежьте скелетные мышцы, прикрепленные к верхней челюсти и скуловой кости, офтальмологическими ножницами. Удалите скелет, лобную кость и мягкие ткани и удалите гнатостегит пластинки с верхнечелюстными коренными зубами.
ПРИМЕЧАНИЕ: Согласно He et al., рекомендуется собирать образец пульпита менее чем через 72 ч после операции, чтобы избежать обширного некрозав ткани пульпы зуба. - Сагиттально разделите гнатостегит пополам и храните ткань в 4% параформальдегиде в PBS, pH 7,4, при 4 °C в течение 24 часов.
8. Гистологический анализ
- Промойте ткани фосфатно-солевым буфером (PBS) и декальцифицируйте их в ежедневно меняемом растворе декальцинации 5% ЭДТА и 4% сахарозы в PBS, pH 7,4, при 4 °C в течение 2-4 недель10.
- Заделайте 1/2 гнатостегит в парафин и убедитесь, что сагиттальное лицо без зубов находится на дне тканевых кассет.
- Парафиновый блок нарезать на ломтики толщиной 5 мкм с помощью парафинового микротома. Отрегулируйте угол парафинового блока в соответствии с проксимальным, дистальным, верхним, а также нижним соотношением, наблюдаемым под микроскопом, чтобы обеспечить возможность разрезания всей пульпы коронки и перфорации первого моляра.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Описанная выше процедура была выполнена на первом моляре правой верхней челюсти у 3 мышей C57BL/6 в возрасте 6-8 недель, при этом первые моляры левой верхней челюсти были сохранены в качестве контроля. Для демонстрации были использованы результаты гистологии и иммунофлюоресценции холостого контроля, образцы пульпита через 12 ч и пульпита через 24 ч.
В соответствии с протоколом КТ-анализа от Goldman et al.15, воздействие пульпы было подтверждено с помощью микро-КТ и реконструктивного моделирования на рисунке 4 A-C. Сагиттальные срезы первых верхнечелюстных первых моляров, как с контрольной, так и со стороны операции, подвергались окрашиванию HE (рис. 5). Показано, что в области края раны наблюдается некроз пульповой ткани и распад клеточной морфологии. Некроз в основном был сосредоточен в пульповой ткани вблизи перфорации, а форма пульповой ткани на неоткрытой стороне была нормальной. Через 24 ч большая часть тканей пульпы, включая пульпу корня, была морфологически интактной. (Рисунок 5).
Экспрессия IL-614 была низкой в контроле, и небольшое количество IL-6 можно было наблюдать вокруг раны через 12 часов, в то время как экспрессия IL-6 была значительно увеличена через 24 часа. Кроме того, экспрессия IL-6 была в основном сосредоточена в крае раны и среднем пульповом роге (рис. 6). На рисунке 6 D,E количество клеток пульпы зуба IL-6+ и отношение клеток IL-6+ к общему количеству клеток пульпы зуба увеличивается с течением времени в трех временных точках. Можно считать, что в этой области постепенно развивается воспаление и обостряется после воздействия пульпы.
Мы пригласили 5 коллег, которые никогда не проводили операции на верхнечелюстных зубах мышей C57, рассчитать время, необходимое для иммобилизации верхней и нижней челюсти мыши (стадия 1) и обнажения первого моляра верхней челюсти мыши (стадия 2) после традиционной процедуры с двумя резиновыми лентами, ссылаясь на протокол, опубликованный Goldman et al., или наш протокол с кляпомдля рта 15. Также было рассчитано время правильной установки бормашины на первый коренной зуб верхней челюсти мыши под микроскопом. Результаты на рисунке 3 J,K свидетельствуют о том, что время фиксации рта и нахождения мышей на первом моляре верхней челюсти с помощью кляпа было значительно сокращено по сравнению с традиционным способом (P<0,05). Использование кляпа для рта может повысить эффективность работы и снизить сложность работы.
Рисунок 1: Схема процедуры воздействия пульпы. (A) После фиксации с помощью рта-кляпа первый коренной зуб верхней челюсти мыши должен быть полностью обнажен под микроскопом. (B) Используйте высокоскоростной стоматологический наконечник с минимально инвазивным зубным заусенцем для удаления окклюзионной эмали и поверхностного дентина первого моляра, но будьте осторожны, чтобы не проникнуть в дентин напрямую, чтобы избежать чрезмерного воздействия на пульпу, вызванного перегревом. (C) Используйте пилку 8# C+, чтобы проникнуть в оставшийся дентин и обнажить пульпу. (D) Образцы были собраны через 24 ч после операции. ПЭ и иммунофлуоресцентное окрашивание доказали, что модель пульпита может быть создана в этот момент времени. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.
Рисунок 2: Оборудование для процедуры воздействия пульпы. (A) Стереоскопический микроскоп и мотор стоматологического высокоскоростного стоматологического наконечника. (B) Напильник 8# C+, минимально инвазивный зубной бор, кляп для рта, пинцет и стоматологический высокоскоростной стоматологический наконечник. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.
Рисунок 3: Изготовление кляпа для рта. (А) Согните проволоку, чтобы сделать два рабочих рычага кляпа. (В-С) Ступени изгиба язычка шпателем для нижней челюсти. (Д-Э) Нет шпателя для языка для верхней челюсти. (Ф, Н) Резиновые колпачки или загнутые концы необходимы для защиты травмы от укола. (G) Три вида рта-кляпа для справки. (I) Клиническое использование кляпа для рта. (J) Среднее время, в течение которого новички фиксируют верхнюю и нижнюю челюсти (этап 1) с использованием традиционного метода фиксации и кляпа для рта, соответственно. (K) Среднее время, за которое новички четко находят первый моляр верхней челюсти (стадия 2) с использованием традиционного метода фиксации и кляпа для рта, соответственно. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.
Рисунок 4: Микрокомпьютерная томография оперированного первого моляра с перфорацией, отмеченной красной пунктирной линией. (A) Сагиттальная плоскость зуба, убедитесь в отсутствии перфорации на дне пульповой камеры. (В) Корональная плоскость. В соответствии с перфорацией в области (А) может наблюдаться полное проникновение дентина эмали, обведенного красной пунктирной линией. (C) Окклюзионная плоскость модели реконструкции КТ. Расположение перфорации, обведенное красной пунктирной линией, подтверждается более интуитивно понятным способом, а дно пульповой камеры можно наблюдать через перфорацию. (Д-Г) Интраоперационные фотографии лечения. (D) Проверьте первый моляр верхней челюсти мыши, чтобы убедиться в отсутствии полостей или пороков развития. (E) Использование минимально инвазивного бора для удаления эмали и неглубокого дентина. Как видно на изображении, на окклюзионной поверхности зуба можно наблюдать ямку (обведенную пунктирной белой линией) без перфорации. (F) Используя пилку 8# C+ для проникновения в оставшийся дентин, пилка может застрять в зубе без поддержки руки. (G) Когда пилка удаляется, зуб имеет розовую перфорацию, что указывает на успешное обнажение пульпы. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.
Рисунок 5: Окрашивание гематоксилин-эозином. (A) Целостный вид необработанного первого моляра для контроля. (А-1,2,3) Цифры с большим увеличением, соответствующие 1, 2, 3 на панели (А). Форма тканей пульпы зуба в 3 положениях была неповрежденной, а одонтобласты располагались упорядоченно. (B) Целостный обзор зубов через 12 часов после операции. (В-1,2,3) Цифры с большим увеличением, соответствующие 1, 2, 3 на панели (В). Форма ткани пульпы зуба в положениях 1 и 2 в целом не была нарушена. Вблизи перфорации можно наблюдать некроз. (C) Целостный обзор зубов через 24 часа после операции. (С-1,2,3) Цифры с большим увеличением, соответствующие 1, 2, 3 на панели (C). Некроз распространяется от одного пульпового рога до близлежащей пульповой ткани. Но большая часть тканей пульпы, в том числе и мякоть корня, морфологически не повреждены. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.
Рисунок 6: Иммунофлуоресцентное окрашивание. (A) Целостный вид необработанного первого моляра для контроля. (А-1,2,3) Цифры с большим увеличением, соответствующие 1, 2, 3 на панели (А). Практически не наблюдалось никакой экспрессии IL-6. (B) Целостный обзор зубов через 12 часов после операции. (В-1, 2, 3) Цифры с большим увеличением, соответствующие 1, 2, 3 на панели (В). Повышение концентрации IL-6 в тканях вблизи перфорации, показанной у B-3. В В-1,2 явных изменений не наблюдалось. (C) Целостный обзор зубов через 24 часа после операции. (С-1, 2, 3) Цифры с большим увеличением, соответствующие 1, 2, 3 на панели (C). Экспрессия ИЛ-6 была достоверно повышена у С-2,3. (D) Общее количество клеток пульпы зуба IL-6+ в контрольной группе, воздействие пульпы через 12 часов, воздействие пульпы на 24 часа с результатами иммунофлуоресцентного окрашивания. (E) Отношение клеток IL-6+ к общему количеству клеток пульпы зуба в контрольной группе, 12-часовое воздействие пульпы, 24-часовое воздействие пульпы результаты иммунофлуоресцентного окрашивания. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Являясь единственной мягкой тканью в зубах, пульпа зуба выполняет решающую роль в поддержании биологической активности зуба, но при этом остается высокочувствительной. Сохранение этой жизненно важной пульпы стало предпочтительным начальным подходом в современных эндодонтических методах лечения, что требует всестороннего понимания воспалительных механизмов пульпы зуба16. Пространственно-временные колебания воспалительного микроокружения и взаимодействия между резидентными типами клеток при пульпите затрудняют его изучение врамках исследований in vitro. Вместо этого исследования in vivo предлагают преимущества, воспроизводя физиологическую среду, обнаруженную у людей. Использование экспериментальных мышей, особенно с гиперэкспрессией или подавленными генами, является эффективным инструментом для проверки гипотез. Однако часто используемые в лабораториях мыши C57 создают проблемы из-за их небольшого размера и отсутствия координации, что делает применение стимулов к их зубам проблематичным17. Чтобы решить эту проблему, необходимо всестороннее объяснение нового рвотного кляпа, которое поможет исследователям в выполнении процедур в полости рта мышей. Кроме того, в этой статье изложен протокол создания модели пульпита путем воздействия пульпы на первый коренной зуб мышей с использованием ротового кляпа, тем самым предлагая ценное руководство для последующих исследований.
После многочисленных итераций был успешно спроектирован масштабируемый ротовой кляп, который легко построить. Размеры и трехсторонняя схема рта-кляпа представлены на рисунке 3. Протокол значительно упростил процесс гибки проволоки за счет использования трапециевидной конструкции вместо дуги. В кляпе используется ортодонтическая дуговая проволока диаметром 0,8 мм, которая уравновешивает необходимость предотвращения соскальзывания изо рта мыши и обеспечивает достаточную силу открытия. Кроме того, эластичность ортодонтической дуговой проволоки защищает височно-нижнечелюстной сустав мышей. Ротовой кляп компактен, устойчив к коррозии и может храниться в центрифужной пробирке объемом 50 мл со спиртом для многократного использования. Несмотря на давление укуса мыши, ротовой кляп остается стабильным во рту, что позволяет исследователям работать без посторонней помощи под микроскопом. Следует отметить, что размер рта-кляпа можно регулировать в соответствии с различными размерами корпуса мыши. Если рот растянут за пределы возможностей мыши, ротовой кляп следует немедленно снять, чтобы избежать травмы височно-нижнечелюстного сустава (ВНЧС) или челюстно-лицевых мышц.
В отчете He et al. указывается, что некроз может быть обнаружен через 24 часа после воздействия пульпы, при этом большая часть пульповой ткани становится некротической через 72 часа18 минут. Следовательно, важно собрать пульповую ткань в течение этого 72-часового окна, чтобы избежать неверных экспериментальных выводов из-за чрезмерного количества мертвых клеток. При вставке файла C+ в камеру пульпы следует избегать многократного вращения и глубокого нажатия, чтобы предотвратить чрезмерное повреждение тканей пульпы. Если во время процедуры возникает сильное кровотечение, рекомендуется аккуратно удалить кровь с помощью небольшого ватного тампона, чтобы предотвратить кашель. Операцию следует проводить только на одной стороне верхней челюсти мыши из-за потенциального негативного влияния на точность моделирования одновременного моделирования с обеих сторон, что может вызвать осложнения при приеме пищи. После операции не рекомендуется давать мышам противовоспалительные препараты или антибиотики.
Кляп для рта, хотя и эффективен для поддержания рта мыши открытым, имеет ограничения в отношении места операции. Задние зубы нижней челюсти, защищенные языком, прижатым депрессором языка, часто не видны четко. Поэтому процедура подходит только для операций на верхних зубах или передних нижних челюстях. Если операция превышает 20 минут, рекомендуется давать мыши перерыв каждые 10 минут, так как стабильность рта-кляпа зависит от антагонизирующей силы прикуса мышей. Мыши C57, выбранные за их быстрое размножение и доступность, чувствительны к различным раздражителям; Следовательно, небольшая передозировка наркотиков или раздражителей может привести к летальному исходу. Кроме того, небольшой размер зубов требует более высокого уровня квалификации для разрезания тканей.
В заключение следует отметить, что воспаление и некроз пульпы представляют собой насущные проблемы в регенерации пульпы. Это исследование предлагает всестороннюю демонстрацию создания модели пульпита у мышей, с результатами иммунофлуоресценции, подтверждающими воспалительные факторы. В этой статье предлагается новая, удобная конструкция рта-кляпа, которая обеспечивает оператору беспрепятственный обзор, держа рот мыши открытым без вмешательства языка. Тем не менее, операции на нижних боковых зубах остаются сложной задачей. Учитывая преимущества использования экспериментальных мышей, эндодонтическое моделирование на мышах имеет значительные перспективы, и планируется ожидать дальнейшего снижения технического порога.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
Acknowledgments
Это исследование было профинансировано грантами Национального фонда естественных наук Китая U21A20368 (L. Y.), 82101000 (H. W.) и 82100982 (F. L.), а также Сычуаньской научно-технической программой 2023NSFSC1499 (H. W.). Все исходные данные и изображения включены в эту статью.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Animal | |||
| C57/B6J mice | Gempharmatech Experimental Animals Company | C57/B6J | For the establishment of pulp exposure |
| Equipment | |||
| 1 mL syringe | Chengdu Xinjin Shifeng Medical Apparatus & Instruments Co. LTD. | SB1-074(IV) | Apply in drug injection. |
| 8# C+ file | Readysteel | 0010047 | Apply in exposing the roof of pulp chamber. |
| Anesthesia Mix solution | 10% ketamine hydrochloride+ 5% xylazine + 85% sterile isotonic saline. | ||
| DAPI Staining Solution | Beyotime | C1005 | Apply in immunofluorescence staining for counter-staining of nucleus. |
| Dental high-speed dental handpiece | Jing yuan electronic commerce technology | WJ-422 | Apply in pulp exposure. |
| Heavy wire cutter | Jirui Medical Instrument Co., Ltd. | none | Apply inarc cutting. |
| Hematoxylin and Eosin Stain kit | Biosharp | BL700B | For the histological analysis of the slides. |
| IL-6 antibody | Novus | NBP2-89149 | Apply in immunofluorescence staining to detect the inflammation of the dental pulp. |
| Ketamine(Ketamine hydrochloride) | Vet One, Boise, Idaho, USA | C3N VT1 | 100mg/kg, IP. Apply in nesthetization. |
| Medical tap | 3M | 1530 | Apply in mice immobilization. |
| Orthodontic arch wire | Shanghai Wei Rong Medical Apparatus Co. LTD. | K417 | Diameter of 8µm |
| Round dental burr (0.6 mm) | Shofu global | 072208 | Apply in removing enamel and shallow layer of dentin. |
| Young loop bending plier | Jirui Medical Instrument Co., Ltd. | none | Apply in arc bending. |
References
- Kleinert, A., Kleinert, L., Ozimirska, M., Chałas, R. Endodontium - together or separately. Folia Morphol. 77 (3), 409-415 (2018).
- Dhillon, H., Kaushik, M., Sharma, R.
- Prati, C., Pirani, C., Zamparini, F., Gatto, M. R., Gandolfi, M. G. A 20-year historical prospective cohort study of root canal treatments. A Multilevel analysis. Int Endod J. 51 (9), 955-968 (2018).
- Su, Y., Wang, C., Ye, L. Healing rate and post-obturation pain of single- versus multiple-visit endodontic treatment for infected root canals: a systematic review. J Endod. 37 (2), 125-132 (2011).
- Murray, P. E., Garcia-Godoy, F., Hargreaves, K. M. Regenerative endodontics: a review of current status and a call for action. J Endod. 33 (4), 377-390 (2007).
- Arora, S., et al. Potential application of immunotherapy for modulation of pulp inflammation: opportunities for vital pulp treatment. Int Endod J. 54 (8), 1263-1274 (2021).
- Eramo, S., Natali, A., Pinna, R., Milia, E. Dental pulp regeneration via cell homing. Int Endod J. 51 (4), 405-419 (2018).
- Hasan, A., et al. Expression of Toll-like receptor 2, Dectin-1, and Osteopontin in murine model of pulpitis. Clin Oral Investig. 27 (3), 1177-1192 (2023).
- Wang, Y., et al. DDIT3 aggravates pulpitis by modulating M1 polarization through EGR1 in macrophages. Int Immunopharmacol. 120, 110328 (2023).
- Richert, R., et al. A critical analysis of research methods and experimental models to study pulpitis. Int Endod J. 55 (Suppl 1), 14-36 (2022).
- Huang, X. F., Zhao, Y. B., Zhang, F. M., Han, P. Y. Comparative study of gene expression during tooth eruption and orthodontic tooth movement in mice. Oral Dis. 15 (8), 573-579 (2009).
- Kwon, S. J., et al. Thermal irritation of teeth during dental treatment procedures. Restor Dent Endod. 38 (3), 105-112 (2013).
- He, Y., et al. Pulpal tissue inflammatory reactions after experimental pulpal exposure in mice. J Endod. 43 (1), 90-95 (2017).
- Karrar, R. N., et al. Molecular biomarkers for objective assessment of symptomatic pulpitis: A systematic review and meta-analysis. Int Endod J. 56 (10), 1160-1177 (2023).
- Goldman, E., Reich, E., Abramovitz, I., Klutstein, M.
- Duncan, H. F. Present status and future directions-Vital pulp treatment and pulp preservation strategies. Int Endod J. 55 (Suppl 3), 497-511 (2022).
- Shi, X., Li, Z., He, Y., Jiang, Q., Yang, X. Effect of different dental burs for experimental induction of pulpitis in mice. Arch Oral Biol. 83, 252-257 (2017).
- Du, W., et al. Indigenous microbiota protects development of medication-related osteonecrosis induced by periapical disease in mice. Int J Oral Sci. 14 (1), 16 (2022).
