Summary
Når mikroprismelinsen integreres med en hovedplade og et optisk design, der er kompatibelt med både enkelt- og to-fotonmikroskoper, udgør den en betydelig fordel ved måling af neurale reaktioner i en lodret søjle under forskellige forhold, herunder velkontrollerede eksperimenter i hovedfaste tilstande eller naturlige adfærdsopgaver i dyr, der bevæger sig frit.
Abstract
Med udviklingen af multifotonmikroskopi og molekylære teknologier vokser fluorescensbilleddannelse hurtigt til at blive en stærk tilgang til at studere strukturen, funktionen og plasticiteten af levende hjernevæv. I sammenligning med konventionel elektrofysiologi kan fluorescensmikroskopi fange den neurale aktivitet såvel som cellernes morfologi, hvilket muliggør langsigtede registreringer af de identificerede neuronpopulationer ved enkeltcelle eller subcellulær opløsning. Imidlertid kræver billeddannelse i høj opløsning typisk en stabil, hovedfast opsætning, der begrænser dyrets bevægelse, og forberedelsen af en flad overflade af gennemsigtigt glas tillader visualisering af neuroner på et eller flere vandrette planer, men er begrænset til at studere de lodrette processer, der løber over forskellige dybder. Her beskriver vi en procedure til at kombinere en hovedpladefiksering og et mikroprisme, der giver flerlags og multimodal billeddannelse. Dette kirurgiske præparat giver ikke kun adgang til hele kolonnen i musens visuelle cortex, men tillader to-fotonbilleddannelse i en hovedfast position og en-fotonbilleddannelse i et frit bevægeligt paradigme. Ved hjælp af denne tilgang kan man prøve identificerede cellepopulationer på tværs af forskellige kortikale lag, registrere deres svar under hovedfaste og frit bevægelige tilstande og spore de langsigtede ændringer over måneder. Således giver denne metode et omfattende assay af mikrokredsløbene, hvilket muliggør direkte sammenligning af neurale aktiviteter fremkaldt af velkontrollerede stimuli og under et naturligt adfærdsparadigme.
Introduction
Fremkomsten af in vivo to-foton fluorescerende billeddannelse 1,2, der kombinerer de nye teknologier inden for optiske systemer og genetisk modificerede fluorescensindikatorer, har vist sig som en kraftfuld teknik inden for neurovidenskab til at undersøge den indviklede struktur, funktion og plasticitet i den levende hjerne 3,4. Især tilbyder denne billeddannelsesmodalitet en enestående fordel i forhold til traditionel elektrofysiologi ved at fange både neuronernes morfologi og dynamiske aktiviteter og derved lette langsigtet sporing af identificerede neuroner 5,6,7,8.
På trods af sine bemærkelsesværdige styrker kræver anvendelsen af fluorescensbilleddannelse med høj opløsning ofte en statisk, hovedfast opsætning, der begrænser dyrets mobilitet 9,10,11. Derudover begrænser brugen af en gennemsigtig glasoverflade til visualisering af neuroner observationer til et eller flere vandrette planer, hvilket begrænser udforskningen af dynamikken i vertikale processer, der strækker sig over forskellige kortikale dybder12.
Ved at adressere disse begrænsninger skitserer denne undersøgelse en innovativ kirurgisk procedure, der integrerer hovedpladefiksering, mikroprisme og miniskop for at skabe en billeddannelsesmodalitet med flerlags og multimodale muligheder. Mikroprismet tillader observation af den lodrette behandling langs den kortikale søjle 13,14,15,16, hvilket er afgørende for at forstå, hvordan information behandles og transformeres, når den bevæger sig gennem forskellige lag af cortex, og hvordan den lodrette behandling ændres under plastiske ændringer. Desuden tillader det billeddannelse af de samme neurale populationer i et hovedfikseret paradigme og i en frit bevægelig indstilling, der omfatter de alsidige eksperimentelle indstillinger 17,18,19: for eksempel kræves hovedfiksering ofte til velkontrollerede paradigmer som sensorisk opfattelsesvurdering og stabile optagelser under 2-fotonparadigme, mens fri bevægelse tilbyder et mere naturligt, fleksibelt miljø til adfærdsstudier. Derfor er evnen til at foretage en direkte sammenligning i begge tilstande afgørende for at fremme vores forståelse af de mikrokredsløb, der muliggør fleksible, funktionelle reaktioner.
I det væsentlige tilbyder integrationen af hovedpladefiksering, mikroprisme og miniskop i fluorescensbilleddannelse en lovende platform til at undersøge forviklingerne i hjernens struktur og funktionalitet. Forskere kan prøve identificerede cellepopulationer på tværs af forskellige dybder, der spænder over alle kortikale lag, direkte sammenligne deres reaktioner i både velkontrollerede og naturlige paradigmer og overvåge deres langsigtede ændringer over måneder20. Denne tilgang giver værdifuld indsigt i, hvordan disse neurale populationer interagerer og ændrer sig over tid under forskellige eksperimentelle forhold, hvilket giver et vindue ind i den dynamiske natur af neurale kredsløb.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle forsøg blev udført i henhold til UK Animals (Scientific Procedures) Act 1986 under personlige og projektlicenser, der er godkendt og udstedt af det britiske indenrigsministerium efter passende etisk gennemgang. Voksne transgene linjer CaMKII-TTA; GCaMP6S-TRE21 blev opdrættet og deres afkom brugt i eksperimentet. Af hensyn til eksperimenternes sikkerhed og opretholdelsen af sterile forhold blev alle procedurer udført under aseptiske forhold og med fuldt personligt beskyttelsesudstyr.
1. Præoperativ forberedelse
- For at minimere ødem skal du administrere Dexamethason (0,2 mg / kg) subkutant 12-24 timer før operationen.
- Steriliser alle kirurgiske værktøjer i en autoklave og steriliser det kirurgiske område med stabiliseret hypochlorsyre med destilleret vand og 70% ethanol før operationen. Sørg for, at alt kirurgisk udstyr er tændt.
- Bedøvelse af dyret (24 uger gammelt, han, der vejer 31 g) ved hjælp af isofluran med en induktionsdosis på 5%, som reduceres til 1%-2%, når musen er på stereotaksisk ramme, medO2 holdt mellem 1-2 l / min. Injicer NSAID'er (Carprofen, 2,5 mg/kg) subkutant.
- Kontroller for fravær af tåklemmerefleks for at vurdere dybden af anæstesi (øg isoflurankoncentrationen i trin på 0,5%, hvis refleks ses).
- Barber dyrets hoved ved hjælp af en trimmer fra bag ørerne til lidt over øjnene. Rengør dette område med en alkoholserviet og povidon-jodopløsning, og sørg for at undgå kontakt med dyrets øjne.
- Monter dyret på den homøtermiske varmepude og stereotaksiske ramme udstyret med øre- og tandstænger og fastgør hovedet. Sørg for, at hovedet er stabilt, da dette er afgørende for, at følgende procedure kan lykkes (figur 1).
- Påfør oftalmisk salve over dyrets øjne for at forhindre dem i at tørre under operationen og dække dem med folie for at beskytte dem mod lys. Dæk dyret med et sterilt kirurgisk dæksel.
Figur 1: Forberedelse før operationen. Musen placeres på den stereotaksiske ramme, sikret med et næsestykke og ørestænger. Musen placeres på en temperaturreguleret opvarmet pude. Øjne har oftalmisk salve på dem og er dækket af aluminiumsfolie. Hovedet er barberet, og kraniet er udsat. Et sterilt dæksel placeres over dyret. Klik her for at se en større version af denne figur.
2. Kraniotomi
- Brug kirurgisk saks til at skære huden langs midterlinjen af det barberede område af hovedet for at udsætte kraniet.
- Rens kraniet med en steril vatpind og fortyndet hydrogenperoxid (3% w/v 35%H2O2i 97%dH2O) i 1-3 s for at fjerne eventuelt bindevæv (figur 2A). Tør kraniet med en dråbe på 70% ethanol og en ny steril vatpind.
- Juster kraniet anteriort / posteriort (AP) og medialt / lateralt (ML) for at sikre et nøjagtigt implantationssted. For at gøre dette skal du måle kraniets dorsoventrale (DV) dybde ved både bregma og lambda og sikre, at forskellen mellem de to er <0,03 mm. For den mediolaterale justering måles lige fjerne punkter på begge parietale knogler fra midterlinjen og igen sikre, at DV-forskellen er <0,03 mm.
- Brug bregma som oprindelse, find og marker det ønskede kortikale område; her er disse monokulære primære visuelle cortex (V1), AP: -3,5 mm, ML: -2,5 mm.
- Brug et trephinbor (1,8 mm diameter) og tandbor (10.000 omdr./min. hastighed) til at eksponere cortex, hvilket sikrer, at mærket for det ønskede kortikale område (monokulært V1) er placeret inden for den nederste tredjedel af borebitvinduet.
- Sørg for, at borets vinkel er vinkelret på kraniets krumning. Dette vil sikre en jævn kraniotomi og forhindre skade på dura eller cortex.
- Bor indtil der er et fald i modstanden, og stop derefter (figur 2B). Fjern forsigtigt det løsrevne knoglefragment med en 23G nålespids (figur 2C).
- Rens den udsatte cortex med kirurgisk skum mættet i kold kunstig cerebrospinalvæske (ACSF) for at fjerne snavs og stoppe enhver blødning, der kan opstå.
- Hold altid den udsatte cortex hydreret ved hjælp af kold ACSF under hele operationen.
Figur 2: Kraniotomi. (A) Hudindsnit mellem bregma og lambda er vist. Bindevæv er fjernet fra den udsatte overflade. (B) Kraniotomi ved trephinboring før fjernelse af knoglefragmentet. (C) Kraniotomi efter fjernelse af knoglefragment, der viser intakt dura og cortex (skalastang repræsenterer 0,5 mm). Klik her for at se en større version af denne figur.
3. Forskåret snit
BEMÆRK: For at blive overvejet, når du udfører det forskårne snit, skal snittet og mikroprismeimplantationen være foran billeddannelsesområdet af interesse (ROI). Dette er for at muliggøre et fuldstændigt og nøjagtigt synsfelt. I forbindelse med denne protokol udføres snittet langs den mediolaterale akse, og mikroprismet orienteres mod den bageste (figur 3B).
- For at hjælpe med indsættelsen og for at lette trykket i cortex under indsættelsen af mikroprismet, lav et snit.
- Fastgør den kirurgiske kniv til den stereotaksiske armholder, og vend bladet eller stereotaksarmen, så den skærer langs ML-aksen.
- Flyt kniven til den ønskede AP-koordinat (AP: -3,4 mm); prismet skal være foran ROI, så gør snittet 100 μm foran billeddannelsens ROI AP-koordinat (-3,5 mm).
- Flyt nu kniven til kraniotomiens mediale kant, hvor den møder kraniet, sænk langsomt kniven, indtil den når knoglen og stop derefter. Da knogletykkelsen er 200 μm, skal denne værdi inkorporeres i den samlede indføringsdybde (se trin 5.1 beregning).
- Optimal billeddannelse er i midten af prismet, dvs. 500 μm; Sørg derfor for, at denne dybde stemmer overens med den kortikale søjledybde (ROI DV: - 0,35 mm).
- Inkorporering af kraniets tykkelse i beregningen af dybde, brug ligningen nedenfor, som bestemmer, hvor dybt det forskårne snit skal være fra overfladen af kraniet. For denne protokol beregnes implantationsdybden som:
Knogletykkelse (200 μm) + billeddannelse ROI (f.eks. 350 μm) + resterende mikroprismedybde (500 μm) = 1.050 μm
- Inkorporering af kraniets tykkelse i beregningen af dybde, brug ligningen nedenfor, som bestemmer, hvor dybt det forskårne snit skal være fra overfladen af kraniet. For denne protokol beregnes implantationsdybden som:
- Sørg for, at snittets længde er mere end 1 mm, men ikke for stort; derfor er en afstand på 1,2 mm ideel, hvor den monokulære ML-koordinat er midt i denne afstand.
- Når du er klar til at udføre snittet, skal du fjerne overskydende ACSF, så synet ikke skjules (figur 3A).
- Flyt kniven fra den mediale kant af kraniotomien til snittets startmediale koordinat. Sænk langsomt (10 μm / s) kniven ned i cortex.
- Når dura er gennemboret og kniven er kommet ind i cortex, påføres en dråbe kold ACSF på cortex for at holde vævet smurt og hydreret under snittet.
- Når den endelige dybde er nået, skal du begynde at bevæge kniven langs ML-aksen (med en hastighed på 10 μm / s).
- Bliv ved med at observere det omgivende væv, mens snittet foretages. Hvis vævet trækker sammen med kniven, skal du flytte kniven op og ned et par gange for at sikre, at vævet skæres, og fortsæt derefter sideværts, og husk at sætte kniven tilbage til sin endelige dybde.
- Når du er færdig, skal du langsomt hæve kniven. Hvis der opstår blod under snittet, skal du bruge denne tid til at rengøre snitstedet med ACSF-gennemblødt kirurgisk skum for at fortynde blodet og skubbe blod inden for snittet ud. Husk at efterlade et friskt, mættet kirurgisk skum over den udsatte cortex, indtil du er klar til at indsætte mikroprismet.
Figur 3: Implantation af mikroprisme. (A) Forskåret snit. (B) Skematisk over den integrerede mikroprismelinse, der viser dens position i cortex (C) Integreret mikroprismelinse i den korrekte retning til forskåret snit før indsættelse i cortex (skalabjælken repræsenterer 0,5 mm). (D) Eksempel på cementopbygning omkring det integrerede lygteglas for at sikre dets fastgørelse til kraniet. Klik her for at se en større version af denne figur.
4. Indføring af mikroprisme og implantation af hovedplade
- Mikroprismelinsen består af et gradientindeksobjektiv fastgjort til et prisme i den distale ende af linsen, som er integreret i en bundplade. Fastgør mikroprismet til implantatsættet.
- Sørg for, at billedsiden af prismet er modsat bundpladeskruen. For at hjælpe med indsættelse og placering af mikroprismet skal du fastgøre det til den stereotaksiske ramme og orientere prismet, så det flugter med snittet (figur 3C).
- Sænk langsomt mikroprismet ned i snitstedet (10 μm / s). Husk at fjerne ACSF, når du først indsætter prismet, men en gang i cortex, skyl med kold ACSF for at smøre indsættelsen.
- Cortex skal forblive stabil, mens prismet sænkes ned i snittet; hvis ikke, tilføj ekstra ACSF og agitér cortex ved at flytte prismet op og ned for at løsne cortex fra prismet.
- Når den endelige dybde er nået, skal du tørre den udsatte kortikale overflade ved hjælp af sterilt væv, og pas på ikke at røre prismet.
- Dæk det blottede kortikale område omkring prismet såvel som linsen med et beskyttende lag silikoneklæbemiddel, hvilket minimerer overskydende klæbemiddel på det omgivende kranium og dummy-kikkert.
- Når den er hærdet (5-10 min), skal du fastgøre hovedpladen til kraniet for at stabilisere hovedet under hovedfast billeddannelse.
- Sørg for, at hovedpladen er bageste nok til ikke at forstyrre implantatets placering og for at tillade tilstrækkelig påføring af cement for korrekt at sikre implantatet.
- Sørg for, at hovedpladens midterlinje ligger lidt til højre for den implanterede linse for at sikre, at begge sider af hovedpladen kan fastgøres til hovedstadiet, når du udfører hovedfaste eksperimenter
- Påfør klæbende cement på hovedpladen og kraniet.
- Forbered klæbende tandcement ved at blande 1 skefuld uigennemsigtigt cementpulver med 4 dråber blandingsmedium og påføre en dråbe katalysator.
- Placer cement på både hovedpladen og kraniet, og hold hovedpladen på plads, indtil den er hærdet, og sørg for, at den er parallel med ørestængerne (gennem visuel undersøgelse skal du inspicere både ovenfra og bag dyrets hoved).
- Påfør klæbende cement for at dække resten af det udsatte kranium og væv, inkorporer mikroprismet (op til bunden af bundpladen) og hovedpladen.
- Få ikke cement på bundpladen, dummymikroskopet eller nogen af dets komponenter. Bliv ved med at påføre klæbecementen, indtil mikroprismet og hovedpladen er dækket og er stabile (figur 3D).
- Når cementen er hærdet, løsnes dukkemikroskopet ved langsomt at bevæge stereotaksarmen opad, mens mikroprismet stabiliseres med pincet (de er forbundet via magneter, derfor kan der mærkes en vis modstand under adskillelsen).
- Sæt beskyttelsesdækslet på objektivet, og stram skruen for at fastgøre det på plads.
- Fjern dyret fra den stereotaxiske ramme, lad det komme sig i en varm genopretningsboks, og administrer opvarmet sterilt 0,9% saltvand subkutant (3% kropsvægt).
- Når dyret er vågent og bevæger sig, skal du placere det tilbage i et rent bur med en enkelt opstaldning. Overvåg dyret og administrer yderligere analgesi efter operationen i henhold til den lokale institutions politik om analgesi.
- Vent i 4 uger efter operationen, dyret skal være klar til billeddannelse.
5. En-foton calciumbilleddannelse af kortikale lag i frit bevægelige mus
BEMÆRK: Det er vigtigt at bruge billeder, der er taget fra den originale billedbehandlingssession hver gang for at sikre nøjagtig erhvervelse af det tilsigtede billedplan. Disse identificerede landemærker spiller sammen med neuronerne en kritisk rolle i justeringsprocessen, der er beskrevet detaljeret i trin 9 i protokollen. Ved erhvervelse af en-fotondata er miniskopet både billeddannelsessystemet og laserkilden. Excitation bruger LED med et effektområde på 0-2 mW/mm2 på målfrontfladen. Laseren bruger en excitationsbølgelængde på 455 ± 8nm (blåt lys) til GCaMP-signalering. Objektivfokusskyderen kan bruges til at justere fokus (Z-aksen), som er repræsenteret på grænsefladen som 0-1000, hvor 0 repræsenterer en arbejdsafstand på 0 μm, og 1000 repræsenterer den maksimale arbejdsafstand på 300 μm.
- Før du henter data, lad dyret akklimatisere sig til rummet og den åbne arena i 1 time før optagelsessessionen.
- Før billeddannelse skal du desinficere og rengøre alt med passende desinfektionsmidler (f.eks. Stabiliseret hypochlorsyre med destilleret vand og 70% ethanol).
- Konfigurer DAQ-boksen ved at slutte den til en computer og starte dataindsamlingssoftwaren. Opret en direkte forbindelse via et ethernet-kabel for at minimere tabte rammer; Den trådløse forbindelsestilstand kan dog være tilstrækkelig afhængigt af styrken af den trådløse forbindelse.
- Fastgør miniskopet til dyrets bundplade under en blid skrubbe.
- Fjern først beskyttelsesdækslet fra bundpladen ved at skrue sætskruen af. Hold dækslet ved dets blænde med tang. Fastgør derefter miniskopet til bundpladen, hvor dækslet sidder.
- Kontroller miniskopets retning i forhold til bundpladen, inden du monterer den, så siden med markeringen af skruen vender mod skruen.
- Når miniskopet er fastgjort, skal du stramme sætskruen for at stabilisere den. Før kun sætskruen frem, indtil der kan mærkes en vis modstand. Overspænding af sætskruen ville potentielt beskadige miniskopet og bør derfor undgås.
- Tilslut miniskopet til DAQ-boksen, og forbered softwaren til optagelse.
- I dataindsamlingssoftwaren skal du tænde for streamen for miniskopet og justere optagelsesparametrene (billedbilledhastighed, forstærkning, LED-effekt, efokuseringsværdi) for at opnå et klart synsfelt (figur 4A).
- Tænd histogramvinduet, og juster forstærkningen og LED-effekten, så den registrerede intensitet sidder mellem 35% og 70% .
- Hvis du udfører en langsgående undersøgelse, skal du se optagelserne eller snapshots taget i en tidligere session og justere efocus-værdien, så det samme billedplan ses tydeligt.
- Start eksperimentet og dataindsamlingen.
- Efter afslutningen af eksperimentet skal du fjerne dyret fra adfærdsapparatet.
- Under en forsigtig skrubbe løsnes sætskruen og fjerner miniskopet fra dyrets bundplade.
- Sæt beskyttelsesdækslet tilbage på bundpladen, og stabiliser det med sætskruen.
- Sæt dyret tilbage i sit hjemmebur (fortsæt til trin 7, hvis du ønsker at behandle enfotondata).
Figur 4: Dataindsamling og -behandling med software. (A) Et billede, der viser realtidsstrømmen fra miniskopet. Det anbefales at justere objektivets fokusværdi, så der ses en klar visning i streamingvinduet sammen med forstærkningen og billedlasereffekten (B) Skematisk graf, der illustrerer den anbefalede justeringsarbejdsgang for sessioner, der er optaget på forskellige tidspunkter. Det anbefales at generere et gennemsnitligt billede fra den første session ved at følge instruktionerne for databehandlingssoftwaren. Dette billede skal bruges som referencebillede under bevægelseskorrektion i de følgende sessioner. (C) Eksempler på fire celler fra det samme maksprojicerede ΔF/F-billede. En orange linje tegnes hen over hver celle for at måle dens cellediameter i pixels, hvis gennemsnit tages som inputargument for celleidentifikationsalgoritmen (øverst til venstre: 13, øverst til højre: 11, nederst til venstre: 12, nederst til højre: 13). (D) Output af celleidentifikationsalgoritmen efter manuel kuratering (billede beskåret). Hvide konturer repræsenterer de identificerede celler (skalalinjen repræsenterer 100 μm). Klik her for at se en større version af denne figur.
6. To-foton calciumbilleddannelse af kortikale lag i hovedfikserede mus
BEMÆRK: Til to-foton laserscanningsmikroskopi er lyskilden en justerbar ultrahurtig laser med en excitationsbølgelængde på 920 nm. Excitationseffekten, målt ved målet, var typisk mellem 100-150 mW og justeret i hver session for at opnå lignende niveauer af fluorescens. Emissionslyset blev filtreret af et emissionsfilter (525/70 nm) og målt af et uafhængigt fotomultiplikatorrør (PMT), kaldet en grøn kanal. Billeder blev erhvervet med et 20x luftnedsænkningsmål (NA = 0,45, 6,9-8,2 mm arbejdsafstand).
- Før du erhverver data, skal du vænne dyret til apparatet i dagene før (for at få dyret til at blive behageligt med adfærdsopsætningen). Lad dyret bruge 15-30 minutter om dagen, i 2-3 dage, på at udforske opsætningen, eller indtil de udviser naturalistisk adfærd, før de begynder dataindsamlingen.
- Tænd for to-fotonbilleddannelsessystemet, start anskaffelsessoftware, og tænd laseren. Sørg for, at laserne er lukkede, og at PMT'erne er slukket, før du fortsætter.
- Rengør to-fotonbilleddannelsesapparatet med stabiliseret hypochlorsyre med destilleret vand og 70% ethanol.
- Sørg for at justere apparatet, så det passer til dyrets størrelse. Fastgør forsigtigt musen og dens hovedplade til head-stage-opsætningen, og skru den på plads for at stabilisere musens hoved.
- Når objektivdækslet er monteret, skal du fjerne det (se trin 5.4.1) og justere målet, så det er over bundpladen.
- Brug epifluorescens- og XYZ-trinkontrollerne til at bringe det kortikale væv i fokus.
- Når de kortikale lag er synlige, skal du skifte mikroskop for at tillade to-fotonbilleddannelse (skift spejlet ud med det dikroiske spejl, luk fluorescerende lukker og sluk for epifluorescenslaseren og skærmen). Sørg for at slukke hovedlysene for at beskytte PMT'erne under billeddannelsen.
- Konfigurer parametre for at optimere hentede billedfiler.
- Brug resonansoptagelsestilstand til calciumbilleddannelse, da den kan fange hurtig affyring af GCaMP-signaler.
- Juster lasereffekt, PMT-forstærkning, zoom og opslagstabeller (LUT'er) for at opnå et optimalt billede, og henvis til en-foton-billedet for at sikre, at det korrekte brændplan afbildes.
- Begynd billeddannelse af kortikale lag med to-fotonsystemet med synkroniseret adfærdsmæssig overvågning og stimulusinput (hvis relevant).
- Sørg for at gemme disse anskaffelsesparametre og XYZ-afstande, hvis du vil gengive identiske billeder over tid.
- Følg nedenstående trin for at registrere en z-stak af de kortikale lag.
- Find flyet til at starte z-stakken fra, juster anskaffelsesparametrene for at optimere billedet, og markér dette som udgangspunktet på softwaren.
- Brug derefter Z-kontrollen til at flytte ned i stakken, kun justere lasereffekten for at opretholde en konstant luminans af stakken og markere slutningen af stakken på softwaren.
- Kritisk trin: Brug indstillingen Relativ eksponentiel gradient under fanen Lasereffektgradient , lad softwaren beregne stigningen i lasereffekt, når den bevæger sig gennem z-stakken. Sørg for at markere slutpunktets lasereffektværdier i tabellen leveret af softwaren, så den kan beregne gradienten.
- Når z-stack-parametrene er indstillet, skal du justere trinstørrelsen (μm).
BEMÆRK: Trinstørrelse bestemmer den tid, det tager, antallet af udsnit og detaljeringskvaliteten af stakken. Mindre trinstørrelser vil resultere i længere anskaffelsestid, en stigning i antallet af udsnit og bedre detaljer sammenlignet med større trinstørrelse. Z-stacks bruges til at hjælpe med registrering af en-foton og to-foton billeder, da de vil fremhæve eventuelle anatomiske vartegn eller funktioner.
- For at erhverve en tidsserie (T-serie) af calciumændringer i neuroner skal du finde et optimalt brændplan ved hjælp af XYZ-trinkontrollerne og justere lasereffekten, PMT-forstærkningen, zoom og LUT'erne.
- Under fanen T-serien i anskaffelsessoftwaren skal du definere parametre for anskaffelsesfrekvens, så de matcher de data, der er indsamlet ved hjælp af en-foton-billeddannelsessystemet.
BEMÆRK: Matchning af frekvensen vil gøre 1P- og 2P-dataene sammenlignelige, og de er bedre egnet til den celleidentifikationsalgoritme, der bruges i databehandlingstrinnene. Flere udløsere og andre erhvervelsestilstande kan inkorporeres i erhvervelsen i T-serien.
- Under fanen T-serien i anskaffelsessoftwaren skal du definere parametre for anskaffelsesfrekvens, så de matcher de data, der er indsamlet ved hjælp af en-foton-billeddannelsessystemet.
- Begynd erhvervelse af T-serien.
7. Behandling af en-foton calciumbilleddata
- Til en-foton-optagelse af film skal du bruge databehandlingssoftwaren, der følger med miniscope-systemet.
- Først skal du forbehandle filmen ved rumlig og tidsmæssig nedsampling. Generelt vil rumlig nedsampling af filmen med en faktor to reducere behandlingstiden betydeligt uden alvorligt at kompromittere celleidentifikationsnøjagtigheden.
- Indstil tidsmæssig nedsamplingsfaktor, så filmens billedhastighed bringes ned til omkring 10 Hz, hvilket er mere egnet til den celleidentifikationsalgoritme, der bruges i de følgende trin.
- Hvis du køber flere film på samme billeddag, skal du kombinere filmene i én tidsserie før forbehandlingstrinnet for at behandle dem sammen.
- Valgfrit: Anvend et rumligt båndpasfilter på filmen for at fjerne de lavere og højere rumlige frekvenser, hvilket resulterer i en jævnere film med højere kontrast.
- Registrer filmen ved hjælp af softwarens bevægelseskorrektionsfunktionalitet. Dette registrerer filmen og korrigerer for bevægelsesartefakter forårsaget af miniskopets bevægelse i forhold til billedoverfladen.
- Kritisk trin: Hvis du udfører en langsgående undersøgelse, skal du registrere filmene til det samme synsfelt, for eksempel det gennemsnitlige billede af filmen taget på den første billeddag (figur 4B).
- Beregn filmens ΔF / F ved hjælp af den tilsvarende fane, og projicer filmen for at generere et maksimalt projektionsbillede af ΔF / F-filmen. Dette billede viser regioner, der viser ændringer i fluorescensniveauer, potentielt individuelle neuroner, og kan bruges til at måle neuronernes gennemsnitlige diameter (figur 4C).
- Alternativt kan du måle cellediameteren på den bevægelseskorrigerede film, hvor neuronerne viser klar fluorescens.
- Identificer celler ved hjælp af algoritmerne i softwaren.
- Mens to muligheder (PCA-ICA og CNMF-E) er tilgængelige på dette trin, skal du bruge CNMF-E til denne undersøgelse. Indtast den gennemsnitlige cellediameter i pixel, og kør algoritmen for at generere et cellesæt, der indeholder interesseområder (ROI'er), der demonstrerer cellelignende aktiviteter.
- Vælg manuelt ROI'er, der er celler (har en cellelignende morfologi og aktivitet 22,23 og ligger inden for FOV) fra dem, der ikke er, og valider det organiserede cellesæt (figur 4D).
- Eksporter calciumsporene for hver ROI til yderligere analyse.
8. Behandling af to-foton calciumbilleddata
- Til to-foton-optagelsesfilm skal du bruge en python-pakke designet til at behandle to-foton calciumanalysedata.
- Først skal du kombinere billederne taget i en T-serie til en .tiff stak som beskrevet nedenfor.
- Under grænsefladen Kør indstillinger skal du justere parametrene, herunder tau-værdien og billedhastigheden, så den matcher den anvendte GCaMP og billedhastigheden for optagelsen.
- Valgfrit: Indstil parameteren do_registration til 1 for at registrere filmen. Dette svarer til bevægelseskorrektionstrinnet beskrevet ovenfor.
- Valgfrit: Indstil parameteren anatomical_only til 1 for at registrere ROI'er ved hjælp af de anatomiske funktioner ud over fluorescensdynamikken. Dette kræver input af cellediameter, så tag målinger ved hjælp af billedbehandlingssoftwaren. Dette anbefales generelt, da det genererer ROI'er med mere naturlige former (figur 5A-C).
- Når alle parametre er indstillet, skal du køre algoritmen, så den udfører alle beregningerne sammen. Se den grafiske brugergrænseflade (GUI) for at kontrollere fremskridtene.
- Når det er gjort, skal du vende tilbage til cellevalgsgrænsefladen for manuel kuratering af celleidentifikationsresultaterne.
- Gem et billede af den organiserede celle oven på filmens maksimale projektion. Dette vil senere blive brugt som referencebillede til registrering af en-fotonoptagelsesdata.
- Algoritmen gemmer derefter resultaterne automatisk. npy-format, som senere kan tilgås med Python. Alternativt kan du gemme resultaterne i andre formaterede filer til yderligere analyse i anden software.
Figur 5: Celleidentifikation ved hjælp af to-foton-behandlingssoftware. (A) Repræsentativt billede af celleidentifikation taget fra to-fotonbehandlingssoftwaren. Indstilling Anatomical_only parameter til 0, men holder alle andre parametre de samme, flere ikke-celler er til stede i området mellem stiplede linjer, der forstyrrer den manuelle kuratering af faktiske celler. (B) Eksempler på cellediametermålinger foretaget fra (A) ved hjælp af billedbehandlingssoftware (øverst til venstre; 7,5 pixel, øverst til højre; 9, nederst til venstre; 6,5, nederst til højre; 7,5). (C) Repræsentativt billede af celleidentifikation. Når du indstiller Anatomical_only parameter til 1 og indtaster den gennemsnitlige cellediameter taget fra (B) i cellediameteralgoritmen, er der ingen celler til stede i området mellem stiplede linjer (skalabjælker repræsenterer 200 μm). Klik her for at se en større version af denne figur.
9. Registrering af identificerede cellesæt på tværs af billedbehandlingsmetoder
- Udfør registrering af celler identificeret fra en-foton- og to-fotonoptagelser med den multimodale billedregistrerings- og analysealgoritme (MIRA), som er tilgængelig via Python-grænsefladen i en-fotonbilledbehandlingssoftwaren.
- Denne algoritme justerer en-foton- og to-fotondataene via ikke-stiv registrering. Se det sæt online demonstrationsnotesbøger, der findes på webstedet og bruges til denne undersøgelse.
BEMÆRK: Notesbøgerne blev skrevet, så al behandling ville blive afsluttet i 1P-softwaren og er derfor ikke kompatible med 2P-behandlingssoftware. Følg derfor kun op med nogle af trinene i notesbøgerne til denne undersøgelse.
- Denne algoritme justerer en-foton- og to-fotondataene via ikke-stiv registrering. Se det sæt online demonstrationsnotesbøger, der findes på webstedet og bruges til denne undersøgelse.
- Følg de trin, der er beskrevet i demonstrationsnotesbøgerne, som involverer generering af et strukturelt billede for hver billedbehandlingsmodalitet. Som standard involverer dette generering af en maksimal projektion af to-foton z-stakken og et gennemsnitligt billede af en-fotonoptagelsen. Alternativt kan du bruge et middelbillede af to-fotonoptagelsen.
- Når du bliver bedt om det, filtrerer rumligt båndpas billederne for bedre at visualisere landemærkerne og omorientere dem, så de matcher.
- Vælg matchende landmærker på de to billeder (figur 6A).
- Brug disse til at beregne den fordrejning, der er nødvendig for at justere de to billeder. Generelt bør 3 til 5 vartegn være tilstrækkelige.
- Algoritmen beregner warp baseret på en kombination af landemærker og billedlighed. Optimer for den relative vægt, der gives til de to faktorer, indtil der opnås tilfredsstillende resultater.
- Fordreje cellekortet, der er erhvervet i en en-foton-session, for at generere et nyt cellekort, der er justeret til to-fotondataene.
- Importer derefter dette forvrængede cellekort til 1P-behandlingssoftwaren for at generere et billede med det maksimale projektionsbillede fra to-fotonfilmen i baggrunden.
- Eksporter dette billede til registreringsformål.
- I programmeringssoftware skal du justere de to billeder, der hidtil er genereret (to-foton-cellekort oven på to-foton maksimalt projektionsbillede) og fordreje en-foton-cellekort oven på to-foton maksimalt projektionsbillede (figur 6B, C).
- For at gøre dette skal du til denne undersøgelse bruge en registreringsestimatorapplikation, der giver brugeren mulighed for at sammenligne resultaterne af forskellige registreringsteknikker. I betragtning af at de to billeder har samme baggrund, var fasekorrelationsteknikken med stiv registrering tilstrækkelig.
- Når registreringen er fuldført, skal du scanne det nu registrerede billede for overlappende investeringsafkast. Dette er ROI'er, der er aktive i begge optagelsessessioner, som kan bruges i yderligere analyse.
Figur 6: Registrering af tværmodalitetsceller ved hjælp af MIRA-arbejdsprocessen. (A) Repræsentativt billede fra cellejusteringsarbejdsprocessen. Det gennemsnitlige billede fra en-foton-dataene vises til venstre, og det fra to-foton-dataene vises til højre. Matchende landmærker fra begge billeder vælges og mærkes i softwaren med et randomiseret farveskema (røde cirkler). (B) Eksempeljusterede billeder, der viser de to identificerede cellesæt, en-foton (lilla) og to-foton (grøn), er overlejret på det gennemsnitlige billede af to-fotondataene. (C) Billede af området markeret med den hvide boks i (B), justerede celler er repræsenteret her som overlappende grønne og lilla konturer. I alle paneler repræsenterer skalabjælken 200 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Metoden til at udføre kronisk flerlags in vivo calciumbilleddannelse af den samme neuronale population over en periode på flere uger ved hjælp af både en- og to-fotonbilleddannelsesmetoder under frit bevægelige og hovedfaste forhold er blevet vist. Her er evnen til at identificere matchende neuronale populationer under en-fotonbilleddannelse, mens dyret udforskede en åben arena i mørket, blevet demonstreret (figur 7A). Calciumspor blev ekstraheret fra de identificerede neuroner og z-scoret til sammenligning (figur 7B). Neuroner viste sammenlignelige niveauer af fluorescens og fyringshastigheder i sessioner, der var 3 ugers mellemrum.
Figur 7: Calciumdynamik fra den primære visuelle cortex kan registreres stabilt på tværs af sessioner, der strækker sig over 3 uger. (A) Rumlige filtre af identificerede neuroner overlejret på de maksimale projektionsbilleder fra tre separate optagelser af det samme synsfelt under en-foton frit bevægelig calciumbilleddannelse, der spænder over en varighed på 3 uger. ROI'er er mærket i den rækkefølge, de præsenteres i (B). Mørke områder i anden (midterste) og tredje (højre) session er resultatet af billedregistrering ved hjælp af den første (venstre) session som reference (skalabjælken repræsenterer 0,5 mm). (B) Z-scorede calciumaktiviteter af de registrerede ROI'er i første (venstre), anden (midterste) og tredje (højre) session vist i (A). Den vandrette skalabjælke er 10 sek., og den lodrette skalabjælke er 10 sd. Klik her for at se en større version af denne figur.
Dernæst blev registreringen af en neuronal population på tværs af forskellige billeddannelsesmetoder demonstreret. En-foton og to-foton billeddannelse sessioner blev udført på samme dag. ROI'er blev identificeret ud fra en-fotondata og manuelt kurateret for at generere et cellekort (figur 8A). På samme måde blev to-fotondata behandlet for at generere et cellekort, hvorved celler automatisk identificeres og manuelt vælges til demonstration. Derefter blev det gennemsnitlige projektionsbillede fra en-foton-sessionen justeret til det maksimale projektionsbillede fra to-foton z-stakken med MIRA-platformen (figur 8B). Dette forvrængede cellekort blev derefter eksporteret, overlejret på det maksimale projektionsbillede med to fotoner og justeret med to-fotoncellekortet (figur 8C). Dette muliggjorde celleidentifikation, der viste aktiviteter af de samme celler under begge billeddannelsesmetoder (figur 8D), som kan bruges til kvantitativ analyse af neuronale reaktioner.
Figur 8: Calciumdynamik fra den primære visuelle cortex registreret mellem forskellige billeddannelsesmetoder. (A) Rumlige filtre af identificerede neuroner overlejret på det maksimale projektionsbillede fra en en-foton, frit bevægelig session. Mærkede neuroner er dem, der med succes blev registreret til to-fotonoptagelsesdata præsenteret i (C). (B) De samme konturer vist i (A) blev fordrejet for at matche de to-foton-sessionsdata, der er vist i (C). (C) Rumlige filtre af ROI'erne vist i (A) efter justering (hvid) og ROI'er identificeret ved hjælp af 2P-behandlingssoftwaren fra en to-fotonhovedfikseret optagelsessession samme dag (grøn), overlejret på det maksimale projektionsbillede fra to-foton-sessionen. Overlappende ROI'er betragtes som registrerede og vælges til yderligere analyse (skalabjælker repræsenterer 0,5 mm). (D) Z-scorede calciumaktiviteter for de registrerede ROI'er i optagelsessessioner med en foton (venstre) og to foton (højre) (vandret skalabjælke er 10 s, og lodret skalabjælke er 10 sd). Klik her for at se en større version af denne figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Her har vi vist evnen til at observere og direkte sammenligne neuroner i hovedfaste og frit bevægelige forhold i de samme neurale populationer. Mens vi demonstrerede applikationen i den visuelle cortex, kan denne protokol tilpasses en lang række andre hjerneområder, både kortikale områder og dybe kerner 24,25,26,27,28 samt andre dataindsamlings- og adfærdsopsætninger 29,30.
Det er vigtigt at notere sig de kritiske trin i denne protokol, da de tillader optimal dataindsamling. For det første, når du udfører z-stacks, er det afgørende at opretholde ensartet luminans hele vejen igennem. Som beskrevet tidligere vil lys sprede sig, jo mere væv det skal trænge igennem; Ved at øge forstærkningen har laseren således mere kraft til at kunne trænge længere ind i vævet og ophidse vores ROI'er. Det anbefales dog ikke at starte z-stakken ved den forstærkning, der kræves for at excitere ROI'er i det dybe væv, da dette vil forårsage overeksponering af fluorescerende strukturer og fototoksicitet og kan blege vævet på overfladen af cortex. Derfor giver valg af indstillingen Relativ eksponentiel gradient softwaren mulighed for at beregne en stabil gradient af effekt, der er nødvendig for at kunne være optimal på hvert trin i z-stakken. For det andet er det næste kritiske skridt til at hjælpe med konsekvent registrering af cellesæt over tid at sikre at gemme det gennemsnitlige billede af filmen taget på den første en-fotonbilleddannelsessession. Dette giver brugeren mulighed for at sammenligne eventuelle efterfølgende billedbehandlingssessioner med det originale billede for at sikre kontinuitet i cellesæt og dataindsamling.
Det er værd at bemærke, at lette miniaturiserede to-fotonmikroskoper er uafhængigt designet 31,32, hvilket tillader billeddannelse i høj opløsning i frit opførte dyr. Selvom det fremhæver et spændende fremskridt for in vivo-billeddannelse i høj opløsning, gør det begrænsede synsfelt (FOV) og det højt specialiserede design det udfordrende for generelle slutbrugere. Den metode, vi beskrev, integrerer flere veletablerede platforme, der er let tilgængelige fra kommercielle leverandører, hvilket gør det til et tilgængeligt valg. I teorien kan det også erstattes med et tilpasset, selvmonteret mikroprisme, der er kompatibelt med et open source-miniskop og et generisk to-fotonmikroskop33,34.
Ikke desto mindre står denne protokol over for udfordringer såsom nøjagtig mikroprismeimplantation, da fejl kan føre til ikke-levedygtige FOV'er og følgelig kompromitterede data. Det er også en udfordring at opretholde konsistente synsvinkler på tværs af forskellige modaliteter på grund af de forskellige mål, der bruges til billeddannelse. Da mikroprismens XY-akser forbliver faste, er variationen i FOV imidlertid langs Z-aksen; derfor anvendes specifikke landemærker, der findes i begge billeddannelsestilstande (såsom blodkar, artefakter i det kortikale væv og identiske neuroner) til at synkronisere FOV'erne. Desuden er det afgørende at anvende registrering til at justere og identificere de samme neuroner under forskellige modaliteter. En anden udfordring at være opmærksom på er at minimere fotoblegning af GCaMP-vævet under erhvervelse i begge modaliteter. Derfor er det vigtigt at reducere den tid, der bruges på optagelse, optimere signal-støj-forholdet (ved at øge forstærkningen i stedet for LED/lasereffekten) og vente 24-48 timer mellem billedbehandlingssessioner.
På trods af disse iboende kompleksiteter giver vores protokol, når den udføres med kirurgisk præcision og passende billedbehandlingsteknikker, en robust platform til sammenligning af neurale aktiviteter. Det muliggør sammenligning mellem hovedfaste tilstande i strengt kontrollerede opgaver og frit bevægelige tilstande, der efterligner mere naturlig adfærd, og dermed udvider de potentielle anvendelser inden for neurovidenskab.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer ingen konkurrerende økonomisk interesse eller interessekonflikt.
Acknowledgments
Vi takker fru Charu Reddy og professor Matteo Carandini (Cortex Lab) for deres råd om kirurgisk protokol og deling af transgen musestamme. Vi takker Dr. Norbert Hogrefe (Inscopix) for hans vejledning og hjælp gennem udviklingen af operationen. Vi takker Andreea Aldea (Sun Lab) for hendes hjælp med den kirurgiske opsætning og databehandling. Dette arbejde blev støttet af Moorfields Eye Charity.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.9% Sodium Chloride solution for infusion (Vetivex 11) 250ml | Dechra | 20091607 | Saline for hydration and drug reconsitution |
| 18004-1 Trephine 1.8mm diameter bur | FST | 18004-18 | Drill bit |
| 1ml syringe | Terumo | MDSS01SE | 1ml syringe |
| 23G x 5/8 inch 6% LUER needle | Terumo | NN-2316R | 23G needle |
| 71000 Automated stereotaxic apparatus w/ built-in software | RWD | - | RWD |
| Absorbable Haemostatic Gelatin Sponge (10x10x10mm) | Surgispon | SSP-101010 | gel-foam |
| Alcohol pads 70% isopropyl alcohol | Braun | 9160612 | Alcohol pads |
| Aluminium foil | Any retailer | - | Foil to cover eyes during surgery |
| Articifical Cerebrospinal Fluid | Tocris Bioscience a Bio-Techne Brand | 3525/25ML | ACSF |
| Automated microinjection pump | WPI | 8091 | |
| Betadine solution (10% iodinated Povidone) 500ml | Videne/Ecolab | 3030440 | Betadine |
| Bruker Ultime 2Pplus (customised) | Bruker | - | Two-photon imaging system |
| Cardiff Aldasorber | Vet-Tech | AN006 | Anaesthesia absorber |
| CFI S Plan Fluor ELWD ADM 20XC | Nikon | MRH48230 | 20x objective lens |
| Compact Anaesthesia system - single gas - isoflurane K/F, with oxygen concentrator model: ZY-5AC and scavenging unit | Vet-Tech | AN001 | Compact anaesthesia system |
| Contec Prochlor | Aston Pharma | AP2111L1 | Disinfectant (hypochlorous acid) |
| Dexamethasone Sodium Phosphate Injection, USP, 4mg/ml, NDC: 0641-6145-25 | Hikma | Covetrus:70789 | Dexamethasone |
| Dissecting Knife, cutting edge 4mm, thickness 0.5mm, stainless steel | Fine Science Tools | 10055-12 | Knife for incisino of cortex |
| Dual-Sided, Non-Puncture Mouse & Neonatal Rat Ear Bars | Stoelting | 51649 | Ear bar |
| Dummy microscope | Inscopix | Dummy microscope | To help with implantation |
| Ethanol (100%) | VWR | 40-1712-25 | Used to make 70% ethanol |
| Fisherbrand Nitrile Indigo Disposable Gloves PPE Cat III | FischerScientific | 17182182 | Gloves |
| Homeothermic Monitor 50-7222-F | Harvard Apparatus | 50-7222-F | Homeothermic monitoring system/heating pad |
| Image processing software | ImageJ | - | Image processing software |
| Inscopix Data Processing Software (IDPS) | Inscopix | - | One-photon calcium imaging processing software |
| Insight Duals-232, S/N 2043 | InSight | Insight Spectra X3 | Two-photon imaging laser |
| IsoFlo 250ml 100% w/w inhalation | Zoetis | WM 42058/4195 | Isoflurane |
| Kwik-Sil Low Toxicity Silicone Adhesive | World Precision Intruments (WPI) | KWIK-SIL | Silicone adhesive |
| MICROMOT mains adapter NG 2/S, w/ Drill unit 60/E | PROXXON | NO 28 515 | Handheld drill |
| nVoke Integrated Imaging and Optogenetics System package | Inscopix | - | One-photon Imaging system and software |
| ProView Implant Kit | Inscopix | ProView Implant Kit | Dummy microscope, stereotaxic arm and attachment |
| ProView Prism Probe | Inscopix | 1050-002203 | Microprism lens |
| Rimadyl (50mg/ml) | Zoetis | VM 42058/4123 | Carprofen |
| Stereotaxis Microscope on Articulated arm with table clamp | WPI | PZMTIII-AAC | Microscope |
| Super-Bond Universal kit, SUN Medical | Prestige-Dental | K058E | Adhesive cement |
| Two-photon calcium image software | Suite2P | - | Two-photon calcium imaging processing software |
| Vapouriser | Vet-Tech | - | Isoflurane vapouriser |
| Xailin Lubricating Eye Ointment 5g | Xailin-Night | MLG/28/1551 | Ophthalmic ointment |
References
- Denk, W., Strickler, J. H., Webb, W. W. Two-photon laser scanning fluorescence microscopy. Science. 248 (4951), 73-76 (1990).
- Svoboda, K., Yasuda, R. Principles of two-photon excitation microscopy and its applications to neuroscience. Neuron. 50 (6), 823-839 (2006).
- Dombeck, D. A., Khabbaz, A. N., Collman, F., Adelman, T. L., Tank, D. W. Imaging large-scale neural activity with cellular resolution in awake, mobile mice. Neuron. 56 (1), 43-57 (2007).
- Vaziri, A., Emiliani, V.
- Holtmaat, A., et al. high-resolution imaging in the mouse neocortex through a chronic cranial window. Nat Protoc. 4 (8), 1128-1144 (2009).
- Sun, Y. J., Sebastian Espinosa, J., Hoseini, M. S., Stryker, M. P. Experience-dependent structural plasticity at pre- and postsynaptic sites of layer 2/3 cells in developing visual cortex. Proc Natl Acad Sci U S A. 116 (43), 21812-21820 (2019).
- Andermann, M. L., Kerlin, A. M., Reid, R. C. Chronic cellular imaging of mouse visual cortex during operant behavior and passive viewing. Front Cell Neurosci. 4, 3 (2010).
- Sofroniew, N. J., Flickinger, D., King, J., Svoboda, K. A large field of view two-photon mesoscope with subcellular resolution for in vivo imaging. Elife. 5, 14472 (2016).
- Puścian, A., Benisty, H., Higley, M. J. NMDAR-dependent emergence of behavioral representation in primary visual cortex. Cell Rep. 32 (4), 107970 (2020).
- Trachtenberg, J. T., et al. Long-term in vivo. imaging of experience-dependent synaptic plasticity in adult cortex. Nature. 420 (6917), 788-794 (2002).
- Seaton, G., et al. Dual-component structural plasticity mediated by αCaMKII autophosphorylation on basal dendrites of cortical layer 2/3 neurones. J Neurosci. 40 (11), 2228-2245 (2020).
- Helmchen, F., Denk, W.
- Andermann, M. L., et al. Chronic cellular imaging of entire cortical columns in awake mice using microprisms. Neuron. 80 (4), 900-913 (2013).
- Chia, T. H., Levene, M. J. Microprisms for in vivo multilayer cortical imaging. J Neurophysiol. 102 (2), 1310-1314 (2009).
- Low, R. J., Gu, Y., Tank, D. W. Cellular resolution optical access to brain regions in fissures: Imaging medial prefrontal cortex and grid cells in entorhinal cortex. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (52), 18739-18744 (2014).
- Buxhoeveden, D. P., Casanova, M. F.
- Chen, S., et al. Miniature fluorescence microscopy for imaging brain activity in freely-behaving animals. Neurosci Bull. 36 (10), 1182-1190 (2020).
- Gulati, S., Cao, V. Y., Otte, S. Multi-layer cortical Ca2+ imaging in freely moving mice with prism probes and miniaturized fluorescence microscopy. J Vis Exp. (124), e55579 (2017).
- Resendez, S. L., et al. Visualization of cortical, subcortical, and deep brain neural circuit dynamics during naturalistic mammalian behavior with head-mounted microscopes and chronically implanted lenses. Nat Protoc. 11 (3), 566-597 (2016).
- Guo, Z. V., et al. Procedures for behavioral experiments in head-fixed mice. PLoS One. 9 (2), 88678 (2014).
- Wekselblatt, J. B., Flister, E. D., Piscopo, D. M., Niell, C. M. Large-scale imaging of cortical dynamics during sensory perception and behavior. J Neurophysiol. 115 (6), 2852-2866 (2016).
- Pnevmatikakis, E. A., et al. Simultaneous denoising, deconvolution, and demixing of calcium imaging data. Neuron. 89 (2), 285-299 (2016).
- Zhou, P., et al. Efficient and accurate extraction of in vivo calcium signals from microendoscopic video data. Elife. 7, 28728 (2018).
- Beckmann, L., et al. Longitudinal deep-brain imaging in mouse using visible-light optical coherence tomography through chronic microprism cranial window. Biomed Opt Express. 10 (10), 5235-5250 (2019).
- Wenzel, M., Hamm, J. P., Peterka, D. S., Yuste, R. Reliable and elastic propagation of cortical seizures in. Cell Rep. 19 (13), 2681-2693 (2017).
- Heys, J. G., Rangarajan, K. V., Dombeck, D. A. The functional micro-organization of grid cells revealed by cellular-resolution imaging. Neuron. 84 (5), 1079-1090 (2014).
- Barson, D., Hamodi, A. S. Simultaneous mesoscopic and two-photon imaging of neuronal activity in cortical circuits. Nat Methods. 17 (1), 107-113 (2020).
- Paquelet, G. E., et al. Single-cell activity and network properties of dorsal raphe nucleus serotonin neurons during emotionally salient behaviors. Neuron. 110 (16), 2664-2679 (2022).
- Yang, Q., et al. Transparent microelectrode arrays integrated with microprisms for electrophysiology and simultaneous two-photon imaging across cortical layers. bioRxiv. , (2022).
- Priestley, J. B., Bowler, J. C., Rolotti, S. V., Fusi, S., Losonczy, A. Signatures of rapid plasticity in hippocampal CA1 representations during novel experiences. Neuron. 110 (12), 1978-1992 (2022).
- Zong, W., et al. Miniature two-photon microscopy for enlarged field-of-view, multi-plane and long-term brain imaging. Nat Methods. 18 (1), 46-49 (2021).
- Engelbrecht, C. J., et al. Ultra-compact fiber-optic two-photon microscope for functional fluorescence imaging in vivo. Opt Express. 16 (8), 5556-5564 (2008).
- Suzuki, M., Aru, J., Larkum, M. E. Double-μ Periscope, a tool for multilayer optical recordings, optogenetic stimulations or both. Elife. 10, 72894 (2021).
- Stibůrek, M., et al. 110 μm thin endo-microscope for deep-brain in vivo observations of neuronal connectivity, activity and blood flow dynamics. Nat Commun. 14 (1), 1897 (2023).
