Waiting
로그인 처리 중...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Epitelcelleinfeksjonsanalyser med Shigella

Published: February 9, 2024 doi: 10.3791/66426
Automatic Translation
*1, *1,2, 1,2
1Mucosal Immunology and Biology Research Center, Division of Pediatric Gastroenterology and Nutrition, Massachusetts General Hospital, 2Department of Pediatrics, Harvard Medical School
* These authors contributed equally

Summary

Den foreliggende protokollen beskriver infeksjonsanalyser for å forhøre Shigella-adherens , invasjon og intracellulær replikasjon ved bruk av in vitro epitelcellelinjer.

Abstract

Det mennesketilpassede enteriske bakterielle patogenet Shigella forårsaker millioner av infeksjoner hvert år, skaper langsiktige veksteffekter blant pediatriske pasienter, og er en ledende årsak til diarédødsfall over hele verden. Infeksjon induserer vannaktig eller blodig diaré som følge av at patogenet passerer mage-tarmkanalen og infiserer epitelcellene som fôrer tykktarmen. Med svimlende økning i antibiotikaresistens og dagens mangel på godkjente vaksiner, er standardiserte forskningsprotokoller avgjørende for å studere dette formidable patogenet. Her presenteres metoder for å undersøke den molekylære patogenesen til Shigella ved hjelp av in vitro-analyser av bakteriell adherens, invasjon og intracellulær replikasjon i kolonepitelceller. Før infeksjonsanalyser ble virulensfenotypen til shigellakolonier verifisert ved opptak av Kongo-rødt fargestoff på agarplater. Supplerte laboratoriemedier kan også vurderes under bakteriedyrking for å etterligne in vivo-forhold . Bakterieceller brukes deretter i en standardisert protokoll for å infisere kolonepitelceller i vevskulturplater ved et etablert infeksjonsmangfold med tilpasninger for å analysere hvert infeksjonsstadium. For adherensanalyser inkuberes Shigella-celler med reduserte medienivåer for å fremme bakteriell kontakt med epitelceller. For både invasjons- og intracellulære replikasjonsanalyser brukes gentamicin i forskjellige tidsintervaller for å eliminere ekstracellulære bakterier og muliggjøre vurdering av invasjon og / eller kvantifisering av intracellulære replikasjonshastigheter. Alle infeksjonsprotokoller oppregner adherente, invaderte og/eller intracellulære bakterier ved serielt å fortynne infiserte epitelcellelysater og plettering av bakteriedannende enheter i forhold til infiserende titere på Kongos røde agarplater. Sammen muliggjør disse protokollene uavhengig karakterisering og sammenligninger for hvert stadium av Shigella-infeksjon av epitelceller for å studere dette patogenet vellykket.

Introduction

Diarésykdommer forårsaket av enteriske bakterielle patogener er en betydelig global helsebyrde. I 2016 var diarésykdommer ansvarlig for 1,3 millioner dødsfall over hele verden og var den fjerde ledende dødsårsaken hos barn yngre enn fem år 1,2. Det gramnegative, enteriske bakterielle patogenet Shigella er årsaken til shigellose, en viktig årsak til diarédødsfall over hele verden3. Shigellose forårsaker betydelig sykelighet og dødelighet hvert år hos barn fra lavere og mellominntektsland 4,5, mens infeksjoner i høyinntektsland er knyttet til barnehage, matbårne og vannbårne utbrudd 6,7,8,9. Ineffektiv vaksineutvikling10 og økende forekomst av antimikrobiell resistens (AMR)11,12 har komplisert håndteringen av store Shigella-utbrudd. Nylige data fra Centers for Disease Control and Prevention viser at nesten 46% av Shigella-infeksjonene i USA viste stoffresistens i 202013,14, mens Verdens helseorganisasjon har erklært Shigella som et AMR-prioritert patogen som det er behov for nye terapier15.

Shigella-infeksjoner overføres lett via fekal-oral rute ved inntak av forurenset mat eller vann, eller gjennom direkte menneskelig kontakt. Shigella har utviklet seg til å bli et effektivt, mennesketilpasset patogen, med en smittsom dose på 10-100 bakterier tilstrekkelig til å forårsake sykdom16. Under tynntarmtransitt blir Shigella utsatt for miljøsignaler, som forhøyet temperatur og galle17. Deteksjon av disse signalene induserer transkripsjonsendringer for å uttrykke virulensfaktorer som forbedrer bakteriens evne til å infisere tykktarmen 17,18,19. Shigella invaderer ikke det kolonale epitelet fra den apikale overflaten, men passerer over epitellaget etter opptak i spesialiserte antigenpresenterende mikrofoldceller (M-celler) i det follikkelassosierte epitelet 20,21,22. Etter transcytose blir Shigella-celler fagocytosert av residente makrofager. Shigella unnslipper raskt fagosomet og utløser makrofagcelledød, noe som resulterer i frigjøring av proinflammatoriske cytokiner 5,23,24. Shigella invaderer deretter kolonepitelceller fra basolateral side, lyserer den makropinocytiske vakuolen og etablerer en replikativ nisje i cytoplasma 5,25. Proinflammatoriske cytokiner, spesielt interleukin-8 (IL-8), rekrutterer polymorfonukleære nøytrofile leukocytter (PMN) til infeksjonsstedet, noe som svekker epiteliale tette overganger, og muliggjør bakteriell infiltrasjon av epitelforingen for å forverre basolateral infeksjon5. PMNene ødelegger den infiserte epitelforingen for å inneholde infeksjonen, noe som resulterer i de karakteristiske symptomene på bacillær (blodig) dysenteri5. Selv om invasjons- og intracellulære replikasjonsmekanismer har blitt grundig karakterisert, demonstrerer ny forskning viktige nye konsepter i Shigella-infeksjon, inkludert virulensregulering under gastrointestinal (GI) transitt17, etterlevelse19, forbedret basolateral tilgang gjennom barrierepermeabilitet26 og asymptomatisk bærerskap hos underernærte barn27.

Shigella spp.s evne til å forårsake diarésykdom er begrenset til mennesker og ikke-menneskelige primater (NHP)28. Shigella tarminfeksjonsmodeller er utviklet for sebrafisk29, mus30, marsvin31, kaniner 21,32,33 og gris34,35. Imidlertid kan ingen av disse modellsystemene nøyaktig replikere sykdomskarakteristika observert under infeksjonhos mennesker 36. Selv om NHP-modeller av shigellose er etablert for å studere Shigella-patogenesen, er disse modellsystemene dyre å implementere og krever kunstig høye smittsomme doser, opptil ni størrelsesordener høyere enn den smittsomme dosen av mennesker 37,38,39,40,41,42. Dermed nødvendiggjør den bemerkelsesverdige tilpasningen av Shigella for infeksjon av menneskelige verter bruk av menneskeavledede cellekulturer for å gjenskape fysiologisk relevante modeller for nøyaktig undersøkelse av Shigella-patogenese.

Her er detaljerte prosedyrer beskrevet for å måle frekvensen av Shigella-adherens til, invasjon av og replikasjon i HT-29 kolonepitelceller. Ved hjelp av disse standardiserte protokollene kan de molekylære mekanismene som bakterielle virulensgener og miljøsignaler påvirker hvert trinn av Shigella-infeksjon , bli forhørt for bedre å forstå det dynamiske vertspatogen-interaksjonsforholdet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Fremstilling av reagenser og materialer

MERK: Alle volumer er konsistente med en analyse ved bruk av to 6-brønnsplater.

  1. TSB medium: Tilsett 0,5 l avionisert (DI) vann til 15 g tryptisk soyabuljong (TSB, se materialfortegnelse) medium og autoklav. Oppbevares i romtemperatur.
  2. Gallesalter medium (TSB + BS): For å tilberede TSB som inneholder 0,4 % (w/v) gallsalter, resuspender 0,06 g gallesalter (BS, se materialtabellen) i 15 ml autoklavert TSB. Filtrer steriliser med et 0,22 μm PES-filter.
    MERK: Gallesaltene består av en 1: 1 blanding av natriumkolat og natriumdeoksykolat. Forbered ferske medier umiddelbart før bruk.
  3. DMEM + 10% (v / v) FBS: Tilsett 5 ml føtal bovint serum (FBS) til 45 ml Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM). Oppbevares ved 4 °C.
  4. DMEM + gentamicin: Tilsett 50 ml DMEM og 50 μL 50 mg/ml gentamicin til et 50 ml rør (se materialfortegnelse).
    MERK: Lag fersk aliquot og varm i et vannbad på 37 °C før hvert eksperiment.
  5. PBS + 1% (v/v) Triton X-100: Tilsett 150 μL Triton X-100 til 15 ml fosfatbufret saltvann (PBS).
    MERK: Lag fersk aliquot og varm i et vannbad på 37 °C før hvert eksperiment.
  6. TSB + Kongo røde indikatorplater: Tilsett 15 g TSB, 7,5 g utvalgt agar og 0,125 g Kongorødt fargestoff (se materialfortegnelse) til en 1 L-flaske. Tilsett 0,5 l DI-vann og autoklav. Hell 10-20 ml media i individuelle sterile petriskåler (100 mm x 15 mm) og la stivne.
    FORSIKTIG: Kongorødt er kreftfremkallende og et reproduktivt giftstoff. Sørge for at håndtering av Kongorødt utføres med egnet personlig verneutstyr. Se databladet for produktsikkerhet for mer informasjon.
    MERK: Omtrent 20 plater er laget av 0,5 l Kongo røde medier. Plater kan tilberedes 2-3 dager i forveien og forlates invertert ved romtemperatur til bruk. For langtidsoppbevaring, plasser inverterte plater i plasthylser ved 4 °C i opptil 3 måneder.
  7. DMEM + 10% (v / v) FBS og 5% (v / v) dimetylsulfoksid (DMSO): Legg til 42,5 ml DMEM, 5 ml FBS og 2,5 ml DMSO til et 50 ml rør. Oppbevares ved 4 °C.

2. Fremstilling av bakterier

MERK: Alle Shigella laboratoriedyrkings- og lagringsprotokoller er tilpasset fra Payne, S. M.43.

FORSIKTIG: Shigella spp. er risikogruppe 2 patogener44. Utfør alt laboratoriearbeid i et BSL-2-miljø, med ytterligere sikkerhetstiltak for å begrense utilsiktet eksponering på grunn av den lave smittsomme dosen av Shigella spp.

  1. Vekst av Shigella fra frosne aksjer
    1. Overfør en liten mengde frossen kultur fra det kryogene hetteglasset til en TSB + Kongo rød agarplate ved hjelp av en steril applikator.
    2. Flamme steriliser en inokulerende sløyfe og la den avkjøles. Strek inokulum frem og tilbake over en kvadrant av platen. Flamme løkken, la den avkjøles, og strek deretter fra den første kvadranten til den andre kvadranten av platen. Gjenta for å streke inokulum i tredje og fjerde kvadranter av platen.
      MERK: Alternativt kan du strekinokulum bruke en fersk steril applikator mellom hver kvadrant.
    3. Inverter platen og inkuber ved 37 °C over natten.
      MERK: Inkubasjon ved temperaturer ≥37 °C er nødvendig for ekspresjon av Shigella virulensfaktorer som er nødvendige for observasjon av Kongo rød-positiv (CR+) fenotype45. Avirulent kolonier vil ha et hvitt utseende og vil ikke være invasiv.
    4. Forsegl platen med parafinfilm og oppbevar i kjøleskap ved 4 °C.
      MERK: Bakteriekolonier vil forbli levedyktige på agarplater i 1-2 uker.
  2. Over natten vekst av Shigella i flytende kultur
    1. Aliquot 3 ml TSB media i sterile 14 ml dyrkningsrør.
    2. Velg en enkelt, godt isolert rød (CR +) koloni ved hjelp av en steril applikator og resuspender i flytende medier.
    3. Inkuber kulturer over natten (16-18 timer) ved 37 °C med risting ved 250 rotasjoner per minutt (rpm).

3. Fremstilling av HT-29 eukaryote celler

MERK: Alle volumer er konsistente med en analyse ved bruk av to 6-brønnsplater. HT-29 cellelinjer ble anskaffet fra American Type Culture Collection (ATCC). HT-29 vedlikeholdsprotokoller er tilpasset fra ATCC anbefalinger46. Alle medier skal forvarmes i et vannbad ved 37 °C før bruk. Alle HT-29 vedlikeholdsprotokoller skal utføres i et biosikkerhetsskap. Avstå fra å produsere bobler når du blander / arbeider med HT-29-celler i media for å unngå dramatiske endringer i pH.

  1. Tining av HT-29-celler fra frossen bestand
    1. Tine hetteglasset med HT-29-celler i et vannbad på 37 °C.
      MERK: Sørg for at hetten holder seg helt over vannet for å unngå forurensning. Tining bør ta mindre enn 2 min.
    2. Fjern hetteglasset fra vannet umiddelbart etter at kulturen er helt tint og dekontaminer med 70% etanol. Forsikre deg om at alle trinnene fra dette punktet utføres ved hjelp av aseptiske teknikker.
    3. Tilsett alt innholdet i hetteglasset til et 15 ml sentrifugerør inneholdende 9 ml DMEM + 10% FBS. Sentrifuge ved 125 x g i 5 min ved romtemperatur.
    4. Dekanter supernatanten i en avfallsbeholder og resuspender pelleten i 10 ml varm DMEM + 10% FBS. Overfør resuspenderte celler til en 75 cm2 vevskulturkolbe (T75) inneholdende 10 ml varm DMEM + 10% FBS (totalt volum på 20 ml).
    5. Inkuber celler ved 37 °C med 5% CO2 til cellene når 90% konfluens (ca. 6-7 dager).
      MERK: Confluency estimeres gjennom visuell tilnærming.
  2. Såing HT-29 celler
    1. Forvarm 20 ml PBS og 50 ml DMEM + 10 % FBS i et vannbad på 37 °C og forvarm 3 ml 0,25 % (w/v) Trypsin-EDTA til romtemperatur.
    2. Når HT-29-celler (fra trinn 3.1) når 90% konfluens, dekanterer HT-29 cellekulturmedier fra T75-kolben i en avfallsbeholder. Hell ~10 ml varm PBS i kolben og roter forsiktig for å vaske. Dekanter PBS i en avfallsbeholder. Vask med varm PBS igjen og dekanter.
    3. Tilsett 2-3 ml med 0,25% (w / v) Trypsin-EDTA og virvle forsiktig over hele overflaten. Inkuber ved 37 °C med 5 % CO2 i 4 minutter.
    4. Fjern kolben fra inkubatoren og forsiktig virvle Trypsin-EDTA, visuelt slik at alle celler løsner fra overflaten.
    5. Tilsett umiddelbart 6 ml varm DMEM + 10% FBS for å deaktivere Trypsin. Pipett opp og ned for å blande grundig.
    6. Overfør alt innholdet til et 15 ml sentrifugerør og spinn det ved 500 x g i 5 minutter ved romtemperatur.
    7. Dekanter supernatanten forsiktig i en avfallsbeholder og resuspender pelleten i 6 ml varm DMEM + 10% FBS.
    8. Umiddelbart etter resuspensjon, overfør 10 μL suspenderte HT-29-celler fra midten av kulturen til et 0,2 ml PCR-rør. Tilsett 10 μL Trypan blått fargestoff til PCR-røret og bland.
    9. Legg til 10 μL HT-29 celle / Trypan blå blanding til en engangs grevinne celle tellerkammer lysbilde (se Tabell over materialer). Oppsummer antall levende celler og beregne celle levedyktighet.
      MERK: Når du dokumenterer antall celler i prøven, les tallet under "levende" celleantall, ikke totalt celleantall. Alternativt kan celleopplisting utføres manuelt ved hjelp av et hemocytometer.
    10. Frø resuspenderte HT-29-celler til en frisk T75-kolbe eller 6-brønnsplate.
      1. For T75 kolbe:
        1. Pipett forsiktig for å blande, og overfør deretter 2,5 x 106 celler til en fersk T75-kolbe i henhold til ligningen nedenfor:
          Equation 1
        2. Tilsett varm DMEM + 10% FBS media til et endelig volum på 20 ml (endelig konsentrasjon på 1,25 x 105 celler / ml).
        3. Spre cellene jevnt over kolben ved å vugge forsiktig frem og tilbake.
        4. Inkuber ved 37 °C med 5 % CO2 til cellene når 80 % konfluens.
          MERK: For optimal vekst, bytt ut DMEM + 10% FBS-mediet i T75-kolben hver ~3 dager. Dekanter mediet i en avfallsbeholder og tilsett 10 ml varm PBS til kolben. Virvle PBS forsiktig rundt og dekanter den inn i avfallsbeholderen. Deretter tilsettes 20 ml frisk, varm DMEM + 10% FBS til kolben og går tilbake til 37 ° C, 5% CO2 -inkubatoren.
      2. For 6-brønns plate:
        1. Pipett forsiktig for å blande, og overfør deretter 5,85 x 106 celler til et nytt 50 ml konisk rør i henhold til ligningen nedenfor:
          Equation 2
        2. Tilsett varm DMEM + 10% FBS media til et endelig volum på 26 ml (endelig konsentrasjon på 2,25 x 105 celler / ml).
        3. Pipett forsiktig for å blande, og dispenser deretter 2 ml (4,5 x 105 celler) i individuelle brønner med 6-brønnsplater.
        4. Spre cellene jevnt over brønnen ved forsiktig å gynge opp / ned og venstre / høyre 2-3x.
        5. Inkuber ved 37 °C med 5% CO2 til cellene når 80% -95% sammenløp (ca. 3-4 dager).
          MERK: 85 % konfluens anbefales for invasjons- og intracellulære replikasjonsanalyser, mens 90 %-95 % konfluens anbefales for etterlevelseanalyser. Cellene skal nå ~85% konfluens etter 48 timers inkubasjon med en endelig konsentrasjon på ca. 1 x 106 celler/brønn. Justeringer av antall sådde celler og lengden på inkubasjonen kan være nødvendig.
  3. Lager frosne HT-29-aksjer
    1. Aliquot 1 ml DMEM + 10% FBS + 5% DMSO media i individuelle kryogene hetteglass.
    2. Legg 1 x 106 HT-29 celler fra trinn 3.2.7 til hvert hetteglass. Beregn volumet av celler i henhold til formelen nedenfor:
      Equation 3
    3. Oppbevar HT-29-celler på lang sikt under -130 °C i flytende nitrogendamplagringsfryser.

4. Analyse av etterlevelse

MERK: Alle volumer er konsistente med en analyse ved bruk av to 6-brønnsplater.

  1. Subkultur over natten Shigella kulturer via 1:50 utvanning i friske medier.
    1. Vortex, tilsett deretter 100 μL av hver overnattingskultur til 5 ml fersk TSB eller TSB + BS i et kulturrør av passende størrelse.
      MERK: Begrens dyrkningsvolumet til <20% av kulturkolben eller rørvolumet for å sikre riktig lufting.
    2. Inkuber ved 37 °C med risting ved 250 o / min til cellene når en optisk tetthet (OD600) på 0,7 (midtloggfase av Shigella-vekst ); ca 2-2,5 timer.
      MERK: Under subkulturen, aliquot 50 ml DMEM og et tilstrekkelig volum PBS for alle vasketrinn og sett i et 37 ° C vannbad. La mediet nå 37 °C før bruk.
  2. Overfør 2 x 108 kolonidannende enheter (CFUer) subkulturert Shigella til individuelle 2 ml mikrosentrifugerør.
    MERK: 2 x 108 CFU tilsvarer omtrent 1 ml bakterieceller ved en OD600 på 0,7. Bruk OD600-avlesninger til å tilnærme CFU / ml i henhold til kalibreringen av hvert enkelt spektrofotometer.
  3. Vask hver Shigella-prøve 2x med PBS.
    1. Pelletsceller ved sentrifugering ved 17 000 x g i 2 min ved romtemperatur. Aspirer supernatanten, tilsett deretter 1 ml varm PBS og resuspender pelleten godt, pipetter prøven forsiktig opp og ned til blandingen er helt homogen (8-10x).
    2. Gjenta trinn 4.3.1 1x ekstra tid.
    3. Pelletsceller ved sentrifugering ved 17 000 x g i 2 minutter ved romtemperatur, aspirer supernatanten og resuspender pellets i 2 ml varm DMEM.
      MERK: Den endelige konsentrasjonen av resuspenderte bakterier vil være 1 x 108 CFU / ml.
  4. Vortex, tilsett deretter 1 ml (1 x 108 CFU) resuspendert Shigella til hver brønn i de tilberedte HT-29 kolonepitelmonolagene i 6-brønnsplater (fra trinn 3.2.10.2).
    MERK: Infeksjoner utføres normalt ved en mangfoldighet av infeksjon (MOI; forholdet mellom bakterielle og epitelceller) på 100. For å teste forskjellige MOIer, fortynn resuspendert Shigella i varm DMEM til ønsket konsentrasjon, og tilsett deretter 1 ml fortynnede bakterier til HT-29 monolayers. For eksempel, for å teste en MOI på 10, fortynn bakterier 1: 10 ved å tilsette 150 μL av 1 x 108 CFU / ml bakterier til 1,35 ml varm DMEM, og bruk deretter 1 ml (1 x 107 CFU) til HT-29 celler.
  5. Inkuber 6-brønnsplatene ved 37 °C med 5% CO2 i 3 timer.
  6. Under inkubasjonen, bestem bakteriell infeksjonstiter.
    1. Klargjør 10 ganger serielle fortynninger av resuspenderte Shigella-celler (fra trinn 4.3.3) til PBS.
    2. Plate 100 μL av 1 x 10-5 og 1 x 10-6 fortynningene på TSB + Kongo røde plater og inkuber over natten ved 37 °C.
      MERK: Plettering av 100 μL fra 1 x 10-5 og 1 x 10-6 fortynninger tilsvarer en endelig fortynningsfaktor på henholdsvis 1 x 10-6 og 1 x 10-7.
  7. Etter inkubering, vask monolayers 4-5x med PBS.
    1. Aspirer medier fra hver brønn.
      MERK: Når du aspirerer medier fra 6-brønnsplater, må du føre spissen av aspiratoren langs undersiden av brønnene, og prøve å unngå kontakt med HT-29-cellene.
    2. Tilsett 1 ml varm PBS i hver brønn og vask forsiktig.
      NOTAT: For å vaske 6-brønns monolag forsiktig med PBS, flytt platen opp og ned og side til side på benkeplaten. Vasking av plater i en sirkulær bevegelse og/eller fjerning av platen fra benkeplaten kan føre til mekanisk fjerning av celler fra plast.
    3. Gjenta trinn 4.7.1 og 4.7.2 4x flere ganger.
  8. Fjern PBS ved aspirasjon og lyse HT-29-celler ved å legge til 1 ml PBS + 1% Triton X-100 til hver brønn.
  9. Inkuber 6-brønnsplater ved 37 °C i 5 minutter.
  10. Bruk en celleskrape eller en bøyd pipettespiss til å skrape de lyserte cellene fra bunnen av brønnen og overfør hele 1 ml til et nytt mikrosentrifugerør på 1,7 ml.
  11. Bestem antall celleassosierte bakterier.
    1. Vortex hver tube (fra trinn 4.10) i minst 30 s for ytterligere å fortrenge Shigella fra de lyserte eukaryote cellene.
    2. Forbered 10 ganger serielle fortynninger av lysater i PBS.
    3. Plate 100 μL av 1 x 10-2, 1 x 10-3 og 1 x 10-4 fortynninger på TSB + Kongo røde plater og inkuber over natten ved 37 °C.
      MERKNAD: Plettering 100 μL fra 1 x 10-2, 1 x 10-3 og 1 x 10-4 fortynninger tilsvarer en endelig fortynningsfaktor på henholdsvis 1 x 10-3, 1 x 10-4 og 1 x 10-5.

5. Invasjonsanalyse

MERK: Alle volumer er konsistente med en analyse ved bruk av to 6-brønnsplater.

  1. Subkultur over natten Shigella kulturer via 1:50 utvanning i friske medier.
    1. Vortex, tilsett deretter 100 μL av hver overnattingskultur til 5 ml fersk TSB eller TSB + BS i et kulturrør av passende størrelse.
      MERK: Begrens dyrkningsvolumet til <20% av kulturkolben eller rørvolumet for å sikre riktig lufting.
    2. Inkuber ved 37 ° C med risting ved 250 o / min til cellene når en OD600 på 0,7 (midtloggfase av Shigella-vekst ); ca 2-2,5 timer.
      MERK: Under subkulturen, aliquot 50 ml DMEM + 50 mg / ml gentamicin og et tilstrekkelig volum PBS for alle vasketrinn og sett i et 37 ° C vannbad. La mediet nå 37 °C før bruk.
  2. Overfør 2 x 108 CFUs subkulturerte Shigella til individuelle 2 ml mikrosentrifugerør.
    MERK: 2 x 108 CFU tilsvarer omtrent 1 ml bakterieceller ved en OD600 på 0,7. Bruk OD600-avlesninger til å tilnærme CFU / ml i henhold til kalibreringen av hvert enkelt spektrofotometer.
  3. Vask Shigella-prøver 1x med PBS.
    1. Pelletsceller ved sentrifugering ved 17 000 x g i 2 min ved romtemperatur. Aspirer supernatanten, tilsett deretter 1 ml varm PBS og resuspender pelleten godt, pipetter prøven forsiktig opp og ned til blandingen er helt homogen (8-10x).
    2. Gjenta trinn 5.3.1. 1x ekstra tid.
    3. Pelletsceller ved sentrifugering ved 17 000 x g i 2 minutter ved romtemperatur, aspirer supernatanten og resuspender pellets i 2 ml varm DMEM.
      MERK: Den endelige konsentrasjonen av resuspenderte bakterier vil være 1 x 108 CFU / ml.
  4. Vortex, tilsett deretter 1 ml (1 x 108 CFUer) resuspendert Shigella pluss 1 ml DMEM til hver brønn i de tilberedte HT-29 kolonepitelmonolagene i 6-brønnsplater (fra trinn 3.2.10.2).
    MERK: Infeksjoner utføres normalt ved en mangfoldighet av infeksjon (MOI; forholdet mellom bakterielle og epitelceller) på 100. For å teste forskjellige MOIer, fortynn resuspendert Shigella i DMEM til ønsket konsentrasjon, og tilsett deretter 1 ml fortynnede bakterier til HT-29 monolag. For eksempel, for å teste en MOI på 10, fortynn bakterier 1: 10 ved å tilsette 150 μL av 1 x 108 CFU / ml bakterier til 1,35 ml DMEM, og tilsett deretter 1 ml (1 x 107 CFUer) til HT-29-celler.
  5. For å fremme bakteriell kontakt med HT-29-cellene, sentrifuger 6-brønnsplatene ved 2000 x g i 10 minutter ved romtemperatur eller 37 °C hvis temperaturinnstillingen kan justeres.
    MERK: Sentrifugering fremmer bakteriell kontakt med HT-29-cellene, som omgår behovet for adherensfaktorer og gjør at bakteriene raskt kan invadere cellene.
  6. Inkuber 6-brønnsplater ved 37 °C med 5 % CO2 i 45 minutter.
  7. Under inkubasjonen, bestem bakteriell infeksjonstiter.
    1. Klargjør 10 ganger serielle fortynninger av resuspenderte Shigella-celler (fra trinn 5.3.3) til PBS.
    2. Plate 100 μL av 1 x 10-5 og 1 x 10-6 fortynningene på TSB + Kongo røde plater og inkuber over natten ved 37 °C.
      MERK: Plettering av 100 μL fra 1 x 10-5 og 1 x 10-6 fortynninger tilsvarer en endelig fortynningsfaktor på henholdsvis 1 x 10-6 og 1 x 10-7.
  8. Vask infiserte HT-29-celler grundig 3x med 1 ml PBS.
    1. Aspirer medier fra hver brønn.
      MERK: Når du aspirerer medier fra 6-brønnsplater, må du føre spissen av aspiratoren langs undersiden av brønnene, og prøve å unngå kontakt med HT-29-cellene.
    2. Tilsett 1 ml varm PBS i hver brønn og vask forsiktig.
      NOTAT: For å vaske 6-brønns monolag forsiktig med PBS, flytt platen opp og ned og side til side på benkeplaten. Vasking av plater i en sirkulær bevegelse og/eller fjerning av platen fra benkeplaten kan føre til mekanisk fjerning av celler fra plast.
    3. Gjenta trinn 5.8.1 og 5.8.2 2x flere ganger.
  9. Fjern PBS ved aspirasjon, tilsett deretter 2 ml varm DMEM supplert med 50 μg / ml gentamicin til hver brønn og inkuber i 30 minutter ved 37 ° C med 5% CO2.
  10. Vask infiserte HT-29-celler grundig 3x med 1 ml PBS.
    1. Gjenta vasken trinn 5.8.
  11. Fjern PBS ved aspirasjon, tilsett deretter 2 ml varm DMEM supplert med 50 μg / ml gentamicin til hver brønn og inkuber i 60 minutter ved 37 ° C med 5% CO2.
  12. Vask infiserte HT-29-celler grundig 3x med 1 ml PBS.
    1. Gjenta vasken trinn 5.8.
  13. Fjern PBS ved aspirasjon og lyse HT-29-celler ved å legge til 1 ml PBS + 1% Triton X-100 til hver brønn.
  14. Inkuber 6-brønnsplater ved 37 °C i 5 minutter.
  15. Bruk en celleskrape eller en bøyd pipettespiss til å skrape de lyserte cellene fra bunnen av brønnen og overfør hele 1 ml til et nytt mikrosentrifugerør på 1,7 ml.
  16. Bestem antall intracellulære bakterier.
    1. Virvel hver tube (fra trinn 5.15) i minst 30 s for ytterligere å fortrenge Shigella fra de lyserte eukaryote cellene.
    2. Forbered 10 ganger serielle fortynninger av lysater i PBS.
    3. Plate 100 μL av 1 x 10-2 og 1 x 10-3 fortynning på TSB + Kongo røde plater og ruges over natten ved 37 °C.
      MERK: Plettering 100 μL fra 1 x 10-2 og 1 x 10-3 fortynninger tilsvarer en endelig fortynningsfaktor på henholdsvis 1 x 10-3 og 1 x 10-4.

6. Intracellulær replikasjonsanalyse

MERK: Alle volumer er konsistente med en analyse ved bruk av to 6-brønnsplater.

  1. Subkultur over natten Shigella kulturer via 1:50 utvanning i friske medier.
    1. Vortex, tilsett deretter 100 μL av hver overnattingskultur til 5 ml fersk TSB eller TSB + BS i et kulturrør av passende størrelse.
      MERK: Begrens dyrkningsvolumet til <20% av kulturkolben eller rørvolumet for å sikre riktig lufting.
    2. Inkuber ved 37 ° C med risting ved 250 o / min til cellene når en OD600 på 0,7 (midtloggfase av Shigella-vekst ); ca 2-2,5 timer.
      MERK: Under subkulturen, aliquot 50 ml DMEM + 50 mg / ml gentamicin og et tilstrekkelig volum PBS for alle vasketrinn og sett i et 37 ° C vannbad. La mediet nå 37 °C før bruk.
  2. Overfør 2 x 108 CFUs subkulturerte Shigella til individuelle 2 ml mikrosentrifugerør.
    MERK: 2 x 108 CFU tilsvarer omtrent 1 ml bakterieceller ved en OD600 på 0,7. Bruk OD600-avlesninger til å tilnærme CFU / ml i henhold til kalibreringen av hvert enkelt spektrofotometer.
  3. Vask Shigella-prøver 1x med PBS.
    1. Pelletsceller ved sentrifugering ved 17 000 x g i 2 min ved romtemperatur. Aspirer supernatanten, tilsett deretter 1 ml varm PBS og resuspender pelleten godt, pipetter prøven forsiktig opp og ned til blandingen er helt homogen (8-10x).
    2. Gjenta trinn 6.3.1. 1x ekstra tid.
    3. Pelletsceller ved sentrifugering ved 17 000 x g i 2 minutter ved romtemperatur, aspirer supernatanten og resuspender pellets i 2 ml varm DMEM.
      MERK: Den endelige konsentrasjonen av resuspenderte bakterier vil være 1 x 108 CFU / ml.
  4. Vortex, tilsett deretter 1 ml (1 x 108 CFU) resuspendert Shigella pluss 1 ml DMEM til hver brønn av tilberedte HT-29 monolayers colonic epithelial i 6-brønnsplater (fra trinn 3.2.10.2).
    MERK: Infeksjoner utføres normalt ved en mangfoldighet av infeksjon (MOI; forholdet mellom bakterielle og epitelceller) på 100. For å teste forskjellige MOIer, fortynn resuspendert Shigella i DMEM til ønsket konsentrasjon, og tilsett deretter 1 ml fortynnede bakterier til HT-29 monolag. For eksempel, for å teste en MOI på 10, fortynn bakterier 1: 10 ved å tilsette 150 μL av 1 x 108 CFU / ml bakterier til 1,35 ml DMEM, og bruk deretter 1 ml (1 x 107 CFUer) til HT-29-celler.
  5. For å fremme bakteriell kontakt med HT-29-cellene, sentrifuger 6-brønnsplatene ved 2000 x g i 10 minutter ved romtemperatur eller 37 °C hvis temperaturinnstillingen kan justeres.
    MERK: Sentrifugering fremmer bakteriell kontakt med HT-29-cellene, som omgår behovet for adherensfaktorer og gjør at bakteriene raskt kan invadere cellene.
  6. Inkuber 6-brønnsplater ved 37 °C med 5 % CO2 i 45 minutter.
  7. Under inkubasjonen, bestem bakteriell infeksjonstiter.
    1. Klargjør 10 ganger serielle fortynninger av resuspenderte Shigella-celler (fra trinn 6.3.3) til PBS.
    2. Plate 100 μL av 1 x 10-5 og 1 x 10-6 fortynningene på TSB + Kongo røde plater og inkuber over natten ved 37 °C.
      MERK: Plettering av 100 μL fra 1 x 10-5 og 1 x 10-6 fortynninger tilsvarer en endelig fortynningsfaktor på henholdsvis 1 x 10-6 og 1 x 10-7.
  8. Vask infiserte HT-29-celler grundig 3x med 1 ml PBS.
    1. Aspirer medier fra hver brønn.
      MERK: Når du aspirerer medier fra 6-brønnsplater, må du føre spissen av aspiratoren langs undersiden av brønnene, og prøve å unngå kontakt med HT-29-cellene.
    2. Tilsett 1 ml varm PBS i hver brønn og vask forsiktig.
      NOTAT: For å vaske 6-brønns monolag forsiktig med PBS, flytt platen opp og ned og side til side på benkeplaten. Vasking av plater i en sirkulær bevegelse og/eller fjerning av platen fra benkeplaten kan føre til mekanisk fjerning av celler fra plast.
    3. Gjenta trinn 6.8.1 og 6.8.2 2x flere ganger.
  9. Fjern PBS ved aspirasjon, tilsett deretter 2 ml varm DMEM supplert med 50 μg / ml gentamicin til hver brønn og inkuber i 30 minutter ved 37 ° C med 5% CO2.
  10. Vask infiserte HT-29-celler grundig 3x med 1 ml PBS.
    1. Gjenta vasken trinn 6.8.
  11. Fjern PBS ved aspirasjon, tilsett deretter 2 ml varm DMEM med 50 μg / ml gentamicin til hver brønn på 6-brønnplatene og inkuber ved 37 ° C med 5% CO2 i ønsket tidsperiode for å tillate intracellulær replikasjon (opptil 24 timer).
  12. Vask cellene grundig 2x med 1 ml PBS.
    1. Gjenta vasken trinn 6.8.
  13. Fjern PBS ved aspirasjon og lyse HT-29-celler ved å legge til 1 ml PBS + 1% Triton X-100 til hver brønn.
  14. Inkuber 6-brønnsplater ved 37 °C i 5 minutter.
  15. Bruk en celleskrape eller bøyd pipettespiss til å skrape lyserte celler fra bunnen av brønnen og overfør hele 1 ml til et nytt 1,7 ml mikrosentrifugerør.
  16. Bestem antall intracellulære bakterier.
    1. Virvel hvert rør (fra trinn 6.15) i minst 30 s for ytterligere å fortrenge Shigella fra de lyserte eukaryote cellene.
    2. Forbered 10 ganger serielle fortynninger av lysater i PBS.
    3. Plate 100 μL av 1 x 10-2, 1 x 10-3 og 1 x 10-4 fortynninger på TSB + Kongo Røde plater og ruges over natten ved 37 °C.
      MERKNAD: Plettering 100 μL fra 1 x 10-2, 1 x 10-3 og 1 x 10-4 fortynninger tilsvarer en endelig fortynningsfaktor på henholdsvis 1 x 10-3, 1 x 10-4 og 1 x 10-5.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Adherens-, invasjons- og intracellulære replikasjonsanalyser ble utført ved å sammenligne S. flexneri 2457T villtype (WT) med S. flexneri ΔVF (ΔVF), en mutant som antas å regulere Shigella-virulens negativt. Siden Shigella bruker gallesalter som et signal for å regulere virulens 17,18,47, ble eksperimenter utført etter bakteriell subkultur i TSB-medier samt TSB supplert med 0,4% (w / v) gallesalter18. Eksponering av gallesalter under subkulturtrinnet fungerer som en forbehandling for å replikere tynntarmtransitt før koloninfeksjon 17,18,47. Figur 1 analyserer effekten av ΔVF-mutasjonen på S. flexneris evne til å feste seg til HT-29 kolonepitelceller. Prosentvis adherens er plottet på y-aksen og representerer forholdet mellom gjenvunnede bakterier etter HT-29 lyse standardisert til antall inngangsbakterier. Som forventet hadde både S. flexneri WT- og ΔVF-stammer en signifikant økning i adherens når de ble subkulturert med gallesalttilskudd sammenlignet med TSB uten gallesalttilskudd18. Det var imidlertid ingen forskjell i adherens til HT-29-celler mellom WT- og ΔVF-mutantstammer innenfor hver subkulturtilstand. Disse dataene indikerer at ΔVF-mutasjonen ikke har noen effekt på S. flexneris evne til å feste seg til HT-29-epitelceller med eller uten gallesaltforbehandling.

I figur 2 ble effekten av ΔVF-mutasjonen på S. flexneris evne til å invadere (figur 2A) og replikere (figur 2B) inne i HT-29 kolonepitelceller med eller uten gallesalter forbehandling analysert. Prosent utvinning er plottet på y-aksen og representerer forholdet mellom gjenvunnede bakterieceller etter HT-29 cellelyse standardisert til antall inngangsbakterier. I figur 2A var det en forventet signifikant økning i evnen til WT S. flexneri 2457T til å invadere HT-29-celler etter preeksponering for gallesalter48, mens S. flexneri ΔVF-mutanten viste en mindre økning i invasjon etter gallesalter preeksponering sammenlignet med WT-stammen.  ΔVF-mutanten hadde økt invasjonsrate av HT-29-celler sammenlignet med WT-subkulturen i TSB, men hadde lignende invasjonsrater som WT når den ble subkulturert i TSB supplert med gallesalter (figur 2A). Disse resultatene tyder på at ΔVF-mutasjonen forbedrer S. flexneris evne til å invadere HT-29-celler, noe som reduserer effekten av gallesaltets preeksponering, selv om invasjonsevnen til ΔVF-mutanten økte ytterligere etter gallesaltsubkultur.

Samlet sett ble 10 ganger flere bakterier gjenvunnet etter inkubasjon over natten (figur 2B) sammenlignet med 90 minutters inkubasjon (figur 2A), som viser forskjellene i overvåking av intracellulær vekst versus invasjon, henholdsvis. Når infiserte HT-29-celler ble inkubert i 18 timer for å muliggjøre intracellulær replikasjon av bakteriene (figur 2B), ble virkningen av gallesaltforbehandlingen redusert for både WT- og ΔVF-stammene. Den reduserte effekten av forbehandling av gallesalter under intracellulær replikasjon var imidlertid mer dramatisk for ΔVF-mutanten. Siden økningen i intracellulær replikasjon av begge stammer når de ble utsatt for gallesalter, var mindre enn økningen i invasjonshastigheter under de samme forholdene, antar vi at gallesalter har større innvirkning på de tidlige trinnene i S. flexneri patogenese. ΔVF-mutanten viste en økning i prosent utvinning fra replikasjon over natten inne i HT-29-celler sammenlignet med WT (figur 2B) etter begge subkulturforholdene. Imidlertid var prosentandelen utvinning av ΔVF-mutanten lik uavhengig av gallesalter før eksponering. Disse datatrendene tyder på at ΔVF-mutanten replikerer mer effektivt inne i HT-29-celler sammenlignet med WT, og at preeksponering av gallesalter ikke påvirker ΔVF-mutantens evne til å replikere intracellulært, som observert for WT (figur 2B). Siden forskjellen mellom mutant- og WT-stammene i gallesaltets preeksponeringstilstand ikke ble observert under 90 minutters invasjonsanalysen, antar vi at produktet kodet av det slettede VF-genet også kan regulere S. flexneri-replikasjon inne i HT-29-celler. Kombinert viser begge analysene at ΔVF-mutanten er mer virulent i forhold til WT, noe som tyder på at VF-genproduktet er en negativ regulator av S. flexneri virulens.

Figure 1
Figur 1: Gallesalter preeksponeringsindusert adherens av S. flexneri til HT-29-celler. S. flexneri 2457T WT og ΔVF mutantceller ble subkulturert i enten TSB eller TSB supplert med 0,4 % (w/v) gallesalter (TSB+BS) medier. Bakteriene ble deretter påført HT-29-celler ved en mangfoldighet av infeksjon (MOI) på 100 og inkubert i 3 timer for å undersøke adherens. Etter inkubasjon ble infiserte HT-29-celler vasket og lysert, og seriefortynninger av gjenvunnede bakterier ble belagt for å telle kolonidannende enheter per ml (CFU / ml). Antall adherente bakterier er plottet i forhold til inngangsbakterietitere for å etablere prosentvis etterlevelse. Data er representative for en biologisk replikat med tre tekniske replikater (individuelle prikker). Feilfelt angir standardfeilen til gjennomsnittet (SEM). Statistisk signifikans ble bestemt ved en Student t-test (*p < 0,05; ***p < 0,001). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 2
Figur 2: Gallesalter før eksponering økte WT S. flexneri invasjon og intracellulær replikasjon. S. flexneri 2457T WT og ΔVF mutantceller ble subkulturert i enten TSB eller TSB supplert med gallesalter (TSB + BS) media. Bakteriene ble deretter påført HT-29-celler ved en MOI på 100, sentrifugert på cellene og inkubert ved 37 ° C med 5% CO2 i 45 minutter. Celler ble vasket med PBS, og ekstracellulære bakterier ble lysert ved tilsetning av gentamicin til DMEM for utelukkende å gjenopprette intracellulære bakterier. Etter 90 minutter (A, bakteriell invasjon) eller 18 timer (B, intracellulær replikasjon) inkubasjoner, ble infiserte HT-29-celler vasket og lysert, og seriefortynninger av gjenvunnede bakterier ble belagt for å telle kolonidannende enheter per ml (CFU / ml). Antall intracellulære bakterier plottes i forhold til inngangsbakterietitere for å fastslå prosentvis utvinning. Data er representative for en biologisk replikat, hver med tre tekniske replikater (individuelle prikker). Feilfelt angir SEM. Statistisk signifikans ble bestemt av en Student t-test (*p < 0,05). Vær oppmerksom på forskjellene i y-akseskalaene mellom panelene (A) og (B). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Denne protokollen beskriver et sett med tre standardiserte analyser for å studere Shigella-etterlevelse, invasjon og intracellulær replikasjon av tarmepitelceller. Selv om disse metodene bare er modifiserte versjoner av klassiske gentamicinanalyser som brukes til å studere invasjonen og intracellulær replikasjon av forskjellige bakterielle patogener i vertsceller 49,50,51, må spesielle hensyn tas når man studerer Shigella.

Shigella er fakultative anaerober, som vokser optimalt ved 37 °C i rikt medium med lufting43. Når du utfører disse analysene for å undersøke effekten av forskjellige miljøsignaler eller metabolitter på Shigella-infeksjoner, anbefales det å dyrke Shigella i rike medier over natten, deretter subkultur i definerte eller supplerte medier til midtloggfasen før infeksjon. Maksimal virulensgenuttrykk forekommer i den logaritmiske vekstfasen52,53. Dermed subkulturerer over natten Shigella kulturer og tillater bakterievekst til eksponentiell fase (OD600 ~ 0,7) er nødvendige skritt for å riktig vurdere Shigella virulens. Videre er virulensgenuttrykk temperaturavhengig. For å sikre spesifisitet for ekspresjon kun under vertsinfeksjon, induseres virulensgener ved vertsfysiologiske temperaturer (37 °C) og strengt undertrykkes ved lavere temperaturer (f.eks. 30 °C)54. For å sikre ekspresjon av virulensgener må bakteriell subkulturering og infeksjoner utføres ved 37 °C, med forsvarlig forsiktighet for å sikre at temperaturen ikke faller under 37 °C. Et stort, 220 kilobasert virulensplasmid, som koder for det molekylære maskineriet som kreves for invasjon og epitelcelleinfeksjon, er en essensiell virulensdeterminant for alle Shigella spp5. Gjentatt passering og forlenget vekst ved 37 °C fremmer virulensplasmidinstabilitet, noe som resulterer i plasmidtap og gjør Shigella-celler avirulent55. For å sikre virulensplasmidvedlikehold og ekspresjon av viktige virulensgener, anbefales det å hvile bakterier direkte fra fryselagre annenhver uke på ferske TSB + Kongo røde indikatorplater. Kongorød agar kan brukes til å skille mellom villtype virulente (røde, CR+) kolonier og avirulent (hvite, CR-) kolonier som har mistet virulensplasmidet45. Hvis virulensplasmidinstabilitet observeres gjentatte ganger, kan nattkulturer av Shigella inkuberes ved 30 °C for å forhindre virulensplasmidtap, etterfulgt av subkultur ved 37 °C for å fremme virulensgenuttrykk43. Til slutt, hvis analyser med mutanter og/eller komplementerte stammer utføres, der antibiotikamarkører er tilstede i disse bakteriestammene, anbefales det å bruke passende antibiotikavalg under bakteriell overnatt og subkultureringstrinn.

Bruken av HT-29 epitelmonolayers har mange fordeler for å studere molekylære mekanismer for Shigella patogenese in vitro. Siden Shigella er et mennesketilpasset patogen, gjenspeiler ikke små dyremodeller nøyaktig den karakteristiske patogenesen av shigellose observert hos mennesker36. Dermed muliggjør bruken av standardiserte protokoller for infeksjon av human-avledede cellelinjer den kvantitative undersøkelsen av individuelle trinn av bakteriell patogenese for å karakterisere det molekylære samspillet mellom dette patogenet og dets opprinnelige vert. Historisk sett ble HeLa-celler hovedsakelig brukt til å studere vertspatogen-interaksjoner in vitro 25,56,57. Imidlertid er HeLa-celler en udødeliggjort cellelinje for livmorhalskreft, som er ikke-innfødte vertsceller for enteriske bakterielle patogener. In vitro-studier av enterisk patogenese har derfor skiftet til bruk av kolonadenokarsinomcellelinjer (f.eks. HT-29, Caco-2 og T84), som mer trofast rekapitulerer intestinal epitelmorfologi, og kan dyrkes på transbrønner som epitelmonolag med differensierte apikale og basolaterale overflater 58,59,60. Selv om hver cellelinje har sine individuelle styrker og svakheter, brukes HT-29-celler i analysene beskrevet her på grunn av fenotypiske likheter med intestinale enterocytter og robust ekspresjon av celleoverflatereseptorer og proinflammatoriske cytokiner 58,59,61. Imidlertid er hver av disse diskuterte modellene kreftavledede cellelinjer med avvikende metabolske og vekstfenotyper som ikke nøyaktig representerer den naturlige fysiologiske tilstanden til kolonepitelet in vivo58. Nylige fremskritt innen humane vevskulturteknikker har muliggjort dyrking av humane intestinale stamceller, oppnådd fra vevsbiopsier, til organoider eller enkle todimensjonale cellemonolag som rekapitulerer de forskjellige celletyper som er tilstede i den humane gastrointestinale (GI) -kanalen 62,63,64. Intestinale organoider kan differensieres for å inkludere enterocytter, slimproduserende begerceller, M-celler og andre vevsspesifikke celletyper. Nylige studier har validert bruken av disse organoidmodellene for å studere enteriske patogener, inkludert forskjellige Shigella spp., Salmonella enterica og Escherichia coli patovarer 62,63,64. Selv om organoider er mer nøyaktige modeller av det humane GI-epitelet og til og med kan dyrkes i varierte næringsforhold for å representere den globale befolkningen65, krever deres relative kompleksitet betydelig opplæring og teknisk ekspertise, noe som resulterer i høyere kostnader og lengre dyrkingstider sammenlignet med tradisjonelle kreftcellelinjer58.

Denne protokollen beskriver medium gjennomstrømningsmetoder, hvor to 6-brønnsplater brukes til totalt 12 monolayers tilgjengelig for testing. Imidlertid kan eksperimenter enkelt skaleres for å øke antall monolayers sådd for å imøtekomme flere tekniske replikater, eller teste flere Shigella mutanter og miljøsignaler. Vevskulturplater med flere brønner (f.eks. 12-brønns eller 24-brønnsplater) kan også brukes med passende justeringer for å ta hensyn til brønner med mindre diametre. Under HT-29-vekstbetingelsene som er skissert i trinn 3.2, er HT-29-titere tilstrekkelig til å så omtrent seks 6-brønnsplater etter dyrking fra en T75-kolbe, med nok gjenværende celler til å opprettholde HT-29-cellekulturen. Videre er såing av HT-29 monolayers og forberedelse av inokulerende bakterietrinn identiske mellom bakteriell adherens, invasjon og intracellulære replikasjonsanalyser. Dermed kan analyser som tester de samme Shigella-stammene eller subkultureringsforholdene, enkelt utføres parallelt for samtidig å undersøke rollen til hver eksperimentell tilstand i forskjellige trinn av Shigella-infeksjon .

Gjenopprettingstitere for adherent (trinn 4), invaderte (trinn 5) og intracellulære bakterier (trinn 6) bestemmes ved plettering av seriefortynninger av infiserte HT-29-celler etter lysis, noe som muliggjør kvantitativ vurdering av effektiviteten av hvert stadium av Shigella-infeksjon. Sentrifugeringstrinnene i invasjons- og intracellulære replikasjonsanalyser, basert på klassiske analyser 49,50,51, fremmer bakteriell kontakt med vertscellene for umiddelbar invasjon og forbedrer invasjonshastigheten. Dermed "hopper" sentrifugeringen over adherenstrinnet, som senere ble oppdaget å være et viktig aspekt ved Shigella-infeksjon 17,18,19,66. Det er viktig å merke seg at sentrifugetrinnet ikke kan utføres med polariserte epitelceller frøet på transbrønner. For adherensanalysen blir imidlertid ikke adherens tvunget ved sentrifugering, og ingen gentamicin tilsettes de infiserte HT-29-cellene før lysis, og tillater dermed oppregning av adherente bakterieceller. Volumet av vevskulturmedier reduseres til 1 ml (i motsetning til 2 ml for invasjons- og intracellulære replikasjonsanalyser) for å muliggjøre mer effektiv kontakt av bakteriene med HT-29-cellene. Videre, avhengig av graden av etterlevelse, kan noen invasjon og intracellulær replikasjon forekomme i løpet av 3 timers inkubasjon, men mengden er vanligvis ubetydelig (f.eks. bare 0,05% av den gjenvunnede bakteriepopulasjonen etter vertscellelyse). Likevel, for å ta hensyn til adherent versus intracellulære bakterier i løpet av 3-timers inkubasjonen, anbefales det å utføre parallelle analyser, hvor, i tillegg til den angitte protokollen, inkuberes en andre plate med 50 μg / ml gentamicin i 2 ml DMEM per brønn i 45 minutter totalt (15 min inkubasjon, vask, fersk DMEM + gentamycin i 30 minutter) for å grundig lyse ekstracellulære bakterier. Etter HT-29 cellelyse som nevnt i protokollen, kan de intracellulære bakteriene oppregnes som nevnt ovenfor, og vil representere antall bakterier som invaderte. Denne verdien kan deretter trekkes fra bakteriene som er oppregnet fra platen uten gentamicinbehandling for å bestemme adherente og invaderte bakterier på riktig måte. Parallelle analyser kan også utføres for å gi mer innsikt i den intracellulære replikasjonen av Shigella inne i HT-29-celler etter invasjon, for eksempel ved å bruke flere tidspunkter for å utføre intracellulære vekstkurver. Til slutt, sammen med opplisting av intracellulære bakterier etter en 18 timers gentamicininkubasjon, kan kultursupernatantene samles og analyseres for cytokinsekresjon av infiserte HT-29-celler. For eksempel er IL-8 et kjemokin, utskilt av epitelceller som i stor grad fungerer for å rekruttere PMN til infeksjonsstedet. Mengden IL-8 utskilt i kulturmediet av infiserte HT-29-celler kan analyseres med en IL-8 ELISA-analyse67.

Gallesalter har vist seg å være et viktig virulenssignal for Shigella under transitt gjennom det humane GI-systemet, og kan brukes til å supplere bakterielle vekstmedier i disse protokollene for å replikere typiske GI-forhold. Naturligvis blir gallsalter introdusert i tolvfingertarmen eller øvre del av tynntarmen for å hjelpe til med fordøyelsen; Og i den ytterste delen av ileum eller enden av tynntarmen fjernes 95 % av gallesaltene og resirkuleres tilbake i sirkulasjon for endelig avleiring i galleblæren68. Gallesalter har vanligvis en konsentrasjon mellom 0,2% -2,0% (w / v) i tynntarmen og er naturlig bakteriedrepende. Imidlertid motstår Shigella, sammen med de fleste enteriske bakterier, gallsalter og bruker signalene til å forbedre infeksjonen47. Flere studier har dokumentert hvordan eksponering av gallesalter, til tider sammen med andre små tarmsignaler som glukose, påvirker Shigella-overlevelse og virulensregulering før infeksjon. Shigella har vist seg å motstå gallsalter, endre genuttrykk og danne og spre en biofilm under forhold som reproduserer liten tarmtransitt 17,69. Studiene har vist at disse endringene resulterer i en hypervirulent fenotype, hvor etterlevelse og invasjon induseres ved påfølgende koloninfeksjon av Shigella 17,18,19,48,66. Dermed dokumenterer betingelsene som er skissert ovenfor hvordan man subkulturerer Shigella i gallsalter for å etterligne tynntarmtransitt før man utfører adherens-, invasjons- eller intracellulære replikasjonsanalyser. Den spesifiserte TSB-formuleringen inneholder tilsatt glukose i forhold til typisk Luria-buljong (LB)17. Således, hvis LB brukes, er det viktig å også supplere mediet med glukose (0,5% -2,0% [w / v]) for å vurdere glukosesignalene i tynntarmen på riktig måte17. Videre, som nevnt ovenfor, vaskes alle Shigella-subkulturer for å fjerne gallsalter og etterligne overgangen til tykktarmen for infeksjonsanalyser.

Tradisjonelt, og som fremhevet i resultatene ovenfor (figur 1 og figur 2), er infeksjonsanalyser verdifulle for å bestemme rollen til et bestemt gen i Shigella-infeksjon . Fenotypen av forskjellige mutanter kan imidlertid ikke bli virkelig verdsatt uten riktig tilskudd av bakteriekulturmediet. Som tidligere forskning har vist, endrer gallesalter signifikant S. flexneri genuttrykk, inkludert gener for sentral metabolisme, transkripsjonsfaktorer, sukkertransportører, stoffresistens og virulensgener enten kodet på kromosomet eller virulensplasmidet17. Disse genene gir innsikt i hvordan Shigella bruker gallesalter som et signal for å endre genuttrykk og forberede seg på eventuell infeksjon i tykktarmen, og påfølgende mutasjonsanalyser må derfor utføres i passende supplerte bakterielle vekstmedier før man undersøker effekter på virulens i adherens-, invasjons- og intracellulære replikasjonsanalyser. Som vist ovenfor i figur 1 og figur 2 påvirket ikke ΔVF-mutasjonen adherens, men påvirket invasjon og intracellulær replikasjon. Siden mutasjonen forbedret invasjonen og intracellulær replikasjon, pågår eksperimenter for tiden for å bestemme hvordan genproduktet regulerer infeksjon. De muterte analysene tjener som et eksempel på hvordan nye forståelser i Shigella-patogenesen kan studeres, spesielt under forhold som bedre replikerer den menneskelige GI-kanalen. Riktige komplementeringsanalyser anbefales for å validere fenotypene til forskjellige mutanter.

I kombinasjon beskriver disse prosedyrene kvantitative eksperimenter som vil gi viktig innsikt i molekylære mekanismer for Shigella-overholdelse av, invasjon av og replikasjon i HT-29 kolonepitelceller ved best å etterligne det naturlige miljøet i den menneskelige GI-kanalen under infeksjon. Fremtidige studier kan utvide mutanter og eksperimentelle forhold for å få en bedre forståelse av hvordan Shigella forbereder seg på og effektivt infiserer menneskelige verter. Til tross for flere tiår med forskning, er det fortsatt så mye mer å oppdage om Shigella-infeksjon.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne oppgir ingen interessekonflikter.

Acknowledgments

Støtte til forfatterne inkluderer Massachusetts General Hospital's Department of Pediatrics, Executive Committee on Research Interim Support Funding (ISF) award 2022A009041, National Institute of Allergy and Infectious Diseases grant R21AI146405, og National Institute of Diabetes and Digestive and Kidney Diseases grant Nutrition Obesity Research Center ved Harvard (NORCH) 2P30DK040561-26. Finansiørene hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om publisering eller utarbeiding av manuskriptet.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.22 μm PES filter Millipore-Sigma SCGP00525 Sterile, polyethersulfone filter for sterilizing up to 50 mL media
14 mL culture tubes Corning 352059 17 mm x 100 mm polypropylene test tubes with cap
50 mL conical tubes Corning 430829 50 mL clear polypropylene conical bottom centrifuge tubes with leak-proof cap
6-well tissue culture plates Corning 3516 Plates are treated for optimal cell attachment
Bile salts Sigma-Aldrich B8756 1:1 ratio of cholate to deoxycholate
Congo red dye Sigma-Aldrich C6277 A benzidine-based anionic diazo dye, >85% purity
Countess cell counting chamber slide Invitrogen C10283 To be used with the Countess Automated Cell Counter
Dimethyl sulfoxide (DMSO) Sigma-Aldrich D8418 A a highly polar organic reagent
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) Gibco 10569-010 DMEM is supplemented with high glucose, sodium pyruvate, GlutaMAX, and Phenol Red
Fetal Bovine Serum (FBS) Sigma-Aldrich F4135 Heat-inactivated, sterile
Gentamicin Sigma-Aldrich G3632 Stock concentration is 50 mg/mL
HT-29 cell line ATCC HTB-38 Adenocarcinoma cell line; colorectal in origin
Paraffin film Bemis PM999 Laboratory sealing film
Petri dishes Thermo Fisher Scientific FB0875713 100 mm x 15 mm Petri dishes for solid media
Phosphate-buffered saline (PBS) Thermo Fisher Scientific 10010049 1x concentration; pH 7.4
Select agar Invitrogen 30391023 A mixture of polysaccharides extracted from red seaweed cell walls to make bacterial plating media
T75 flasks Corning 430641U Tissue culture flasks
Triton X-100 Sigma-Aldrich T8787 A common non-ionic surfactant and emulsifier 
Trypan blue stain Invitrogen T10282 A dye to detect dead tissue culture cells; only live cells can exclude the dye
Trypsin-EDTA Gibco 25200-056 Reagent for cell dissociation for cell line maintenance and passaging
Tryptic Soy Broth (TSB) Sigma-Aldrich T8907 Bacterial growth media

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Karambizi, N. U., McMahan, C. S., Blue, C. N., Temesvari, L. A. Global estimated Disability-Adjusted Life-Years (DALYs) of diarrheal diseases: A systematic analysis of data from 28 years of the global burden of disease study. PloS one. 16 (10), e0259077 (2021).
  2. WHO. WHO methods and data sources for country-level causes of death 2000-2016. World Health Organization. , Geneva. (2018).
  3. Kotloff, K. L. Shigella infection in children and adults: a formidable foe. Lancet Glob Health. 5 (12), e1166-e1167 (2017).
  4. Kotloff, K. L., et al. Burden and aetiology of diarrhoeal disease in infants and young children in developing countries (the Global Enteric Multicenter Study, GEMS): A prospective, case-control study. Lancet. 382 (9888), 209-222 (2013).
  5. Schroeder, G. N., Hilbi, H. Molecular pathogenesis of Shigella spp.: Controlling host cell signaling, invasion, and death by type III secretion. Clin Microbiol Rev. 21 (1), 134-156 (2008).
  6. Arvelo, W., et al. Transmission risk factors and treatment of pediatric shigellosis during a large daycare center-associated outbreak of multidrug resistant shigella sonnei: Implications for the management of shigellosis outbreaks among children. Pediatr Infect Dis J. 28 (11), 976-980 (2009).
  7. Kozyreva, V. K., et al. Recent outbreaks of Shigellosis in California caused by two distinct populations of Shigella sonnei with either increased virulence or fluoroquinolone resistance. mSphere. 1 (6), 1-18 (2016).
  8. Bowen, A., et al. Importation and domestic transmission of Shigella sonnei resistant to ciprofloxacin - United States, May 2014-February 2015. MMWR Morb Mortal Wkly Rep. 64 (12), 318-320 (2015).
  9. Tansarli, G. S., et al. Genomic reconstruction and directed interventions in a multidrug-resistant Shigellosis outbreak in Seattle, WA, USA: a genomic surveillance study. Lancet. 3099 (22), 1-11 (2023).
  10. Barry, E. M., et al. Progress and pitfalls in Shigella vaccine research. Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 10 (4), 245-255 (2013).
  11. Increase in Extensively Drug-Resistant Shigellosis in the United States. CDC Health Alert Network. Centers for Disease Control and Prevention. , Available from: https://emergency.cdc.gov/han/2023/han00486.asp?ACSTrackingID=USCDC_511-DM100260&ACSTrackingLabel=HAN%20486%20-%20General%20Public&deliveryName=USCDC_511-DM100260 (2023).
  12. Shiferaw, B., et al. Antimicrobial susceptibility patterns of Shigella isolates in Foodborne Diseases Active Surveillance Network (FoodNet) sites, 2000-2010. Clin Infect Dis. 54, S458-S463 (2012).
  13. Centers for Disease Control and Prevention. COVID-19: U.S. Impact on Antimicrobial Resistance, Special Report 2022. Atlanta, GA: U.S. Department of Health and Human Services. CDC. , (2022).
  14. Centers for Disease Control and Prevention. Antibiotic resistance threats in the United States, 2019. CDC. 10 (1), Atlanta, Georgia. (2019).
  15. WHO. Prioritization of pathogens to guide discovery, research and development of new antibiotics for drug-resistant bacterial infections, including tuberculosis. WHO. , Geneva. (2017).
  16. DuPont, H. L., Levine, M. M., Hornick, R. B., Formal, S. B. Inoculum size in shigellosis and implications for expected mode of transmission. J Infect Dis. 159 (6), 1126-1128 (1989).
  17. Nickerson, K. P., et al. Analysis of Shigella flexneri resistance, biofilm formation, and transcriptional profile in response to bile salts. Infect Immun. 85 (6), 1-18 (2017).
  18. Faherty, C. S., Redman, J. C., Rasko, D. A. Shigella flexneri effectors OspE1 and OspE2 mediate induced adherence to the colonic epithelium following bile salts exposure. Mol Microbiol. 85 (1), 107-121 (2012).
  19. Chanin, R. B., et al. Shigella flexneri adherence factor expression in in vivo-like conditions. mSphere. 4 (6), e00751 (2019).
  20. Baranov, V., Hammarström, S. Carcinoembryonic antigen (CEA) and CEA-related cell adhesion molecule 1 (CEACAM1), apically expressed on human colonic M cells, are potential receptors for microbial adhesion. Histochem Cell Biol. 121 (2), 83-89 (2004).
  21. Wassef, J. S., Keren, D. F., Mailloux, J. L. Role of M cells in initial antigen uptake and in ulcer formation in the rabbit intestinal loop model of shigellosis. Infect Immun. 57 (3), 858-863 (1989).
  22. Sansonetti, P. J., Arondel, J., Cantey, J. R., Prévost, M. C., Huerre, M. Infection of rabbit Peyer's patches by Shigella flexneri: Effect of adhesive or invasive bacterial phenotypes on follicle-associated epithelium. Infect Immun. 64 (7), 2752-2764 (1996).
  23. Sansonetti, P. J., et al. Caspase-1 activation of IL-1beta and IL-18 are essential for Shigella flexneri-induced inflammation. Immunity. 12 (5), 581-590 (2000).
  24. Zychlinsky, A., Fitting, C., Cavaillon, J. M., Sansonetti, P. J. Interleukin 1 is released by murine macrophages during apoptosis induced by Shigella flexneri. J Clin Invest. 94 (3), 1328-1332 (1994).
  25. Sansonetti, P. J., Ryter, A., Clerc, P., Maurelli, A. T., Mounier, J. Multiplication of Shigella flexneri within HeLa cells: lysis of the phagocytic vacuole and plasmid-mediated contact hemolysis. Infect Immun. 51 (2), 461-469 (1986).
  26. Maldonado-Contreras, A., et al. Shigella depends on SepA to destabilize the intestinal epithelial integrity via cofilin activation. Gut Microbes. 8 (6), 544-560 (2017).
  27. Collard, J. -M., et al. High prevalence of small intestine bacteria overgrowth and asymptomatic carriage of enteric pathogens in stunted children in Antananarivo, Madagascar. PLoS Negl Trop Dis. 16 (5), e0009849 (2022).
  28. Mattock, E., Blocker, A. J. How do the virulence factors of shigella work together to cause disease. Front Cell Infect Microbiol. 7, 1-24 (2017).
  29. Mostowy, S., et al. The zebrafish as a new model for the in vivo study of Shigella flexneri interaction with phagocytes and bacterial autophagy. PLoS Pathog. 9 (9), e1003588 (2013).
  30. Martinez-Becerra, F. J., et al. Parenteral immunization with IpaB/IpaD protects mice against lethal pulmonary infection by Shigella. Vaccine. 31 (24), 2667-2672 (2013).
  31. Shim, D. -H., et al. New animal model of shigellosis in the Guinea pig: its usefulness for protective efficacy studies. J Immunol. 178 (4), Baltimore, Md. 2476-2482 (2007).
  32. Marteyn, B., et al. Modulation of Shigella virulence in response to available oxygen in vivo. Nature. 465 (7296), 355-358 (2010).
  33. West, N. P., et al. Optimization of virulence functions through glucosylation of Shigella LPS. Science. 307 (5713), 1313-1317 (2005).
  34. Maurelli, A. T., et al. Shigella infection as observed in the experimentally inoculated domestic pig, Sus scrofa domestica. Microbial Pathog. 25 (4), 189-196 (1998).
  35. Jeong, K. -I., Zhang, Q., Nunnari, J., Tzipori, S. A piglet model of acute gastroenteritis induced by Shigella dysenteriae Type 1. J Infect Dis. 201 (6), 903-911 (2010).
  36. Kim, Y. -J., Yeo, S. -G., Park, J. -H., Ko, H. -J. Shigella vaccine development: prospective animal models and current status. Curr Pharm Biotechnol. 14 (10), 903-912 (2013).
  37. Kent, T. H., Formal, S. B., LaBrec, E. H., Sprinz, H., Maenza, R. M. Gastric shigellosis in rhesus monkeys. Am J Pathol. 51 (2), 259-267 (1967).
  38. Shipley, S. T., et al. A challenge model for Shigella dysenteriae 1 in cynomolgus monkeys (Macaca fascicularis). Comp Med. 60 (1), 54-61 (2010).
  39. Higgins, R., Sauvageau, R., Bonin, P. Shigella flexneri Type 2 Infection in captive nonhuman primates. Can Vet J. 26 (12), 402-403 (1985).
  40. Oaks, E. V., Hale, T. L., Formal, S. B. Serum immune response to Shigella protein antigens in rhesus monkeys and humans infected with Shigella spp. Infect Immun. 53 (1), 57-63 (1986).
  41. Formal, S. B., et al. Protection of monkeys against experimental shigellosis with a living attenuated oral polyvalent dysentery vaccine. J Bacteriol. 92 (1), 17-22 (1966).
  42. Levine, M. M., Kotloff, K. L., Barry, E. M., Pasetti, M. F., Sztein, M. B. Clinical trials of Shigella vaccines: two steps forward and one step back on a long, hard road. Nat Rev Microbiol. 5 (7), 540-553 (2007).
  43. Payne, S. M. Laboratory cultivation and storage of Shigella. Curr Protoc Microbiol. 55 (1), 93 (2019).
  44. NIH Guidelines. NIH guidelines for research involving recombinant or synthetic nucleic acid molecules. NIH Guidelines. 2, 142 (2019).
  45. Maurelli, A. T., Blackmon, B., Curtiss, R. Loss of pigmentation in Shigella flexneri 2a is correlated with loss of virulence and virulence-associated plasmid. Infect Immun. 43 (1), 397-401 (1984).
  46. HT-29 cell line product sheet. ATCC. , Available from: https://www.atcc.org/products/htb-38 1-6 (2023).
  47. Sistrunk, J. R., Nickerson, K. P., Chanin, R. B., Rasko, D. A., Faherty, C. S. Survival of the fittest: How bacterial pathogens utilize bile to enhance infection. Clin Microbiol Rev. 29 (4), 819-836 (2016).
  48. Stensrud, K. F., et al. Deoxycholate interacts with IpaD of Shigella flexneri in inducing the recruitment of IpaB to the type III secretion apparatus needle tip. J Biol Chem. 283 (27), 18646-18654 (2008).
  49. Mandell, G. L. Interaction of intraleukocytic bacteria and antibiotics. J Clin Invest. 52 (7), 1673-1679 (1973).
  50. Elsinghorst, E. A. Measurement of invasion by gentamicin resistance. Methods Enzymo. 236 (1979), 405-420 (1994).
  51. Elsinghorst, E. A., Weitz, J. A. Epithelial cell invasion and adherence directed by the enterotoxigenic Escherichia coli tib locus is associated with a 104-kilodalton outer membrane protein. Infect Immun. 62 (8), 3463-3471 (1994).
  52. Dorman, C. J., McKenna, S., Beloin, C. Regulation of virulence gene expression in Shigella flexneri, a facultative intracellular pathogen. Int J Med Microbiol. 291 (2), 89-96 (2001).
  53. Porter, M. E., Dorman, C. J. Positive regulation of Shigella flexneri virulence genes by integration host factor. J Bacteriol. 179 (21), 6537-6550 (1997).
  54. Maurelli, A. T., Blackmon, B., Curtiss, R. Temperature-dependent expression of virulence genes in Shigella species. Infect Immun. 43 (1), 195-201 (1984).
  55. Schuch, R., Maurelli, A. T. Virulence plasmid instability in Shigella flexneri 2a is induced by virulence gene expression. Infect Immun. 65 (9), 3686-3692 (1997).
  56. Formal, S. B., Hale, T. L., Sansonetti, P. J. Invasive enteric pathogens. Rev Infect Dis. 5, S702-S707 (1983).
  57. Pál, T., Hale, T. L. Plasmid-associated adherence of Shigella flexneri in a HeLa cell model. Infect Immun. 57 (8), 2580-2582 (1989).
  58. Noben, M., et al. Human intestinal epithelium in a dish: Current models for research into gastrointestinal pathophysiology. United European Gastroenterol J. 5 (8), 1073-1081 (2017).
  59. Liévin-Le Moal, V., Servin, A. L. Pathogenesis of human enterovirulent bacteria: lessons from cultured, fully differentiated human colon cancer cell lines. Microbiol Mol Biol Rev R. 77 (3), 380-439 (2013).
  60. Mitchell, D. M., Ball, J. M. Characterization of a spontaneously polarizing HT-29 cell line, HT-29/cl.f8. In Vitro Cell Dev Biol - Anim. 40 (10), 297-302 (2004).
  61. Gagnon, M., Zihler Berner, A., Chervet, N., Chassard, C., Lacroix, C. Comparison of the Caco-2, HT-29 and the mucus-secreting HT29-MTX intestinal cell models to investigate Salmonella adhesion and invasion. J Microbiol Methods. 94 (3), 274-279 (2013).
  62. Koestler, B. J., et al. Human intestinal enteroids as a model system of Shigella pathogenesis. Infect Immun. 87 (4), 00733 (2019).
  63. Ranganathan, S., et al. Evaluating Shigella flexneri pathogenesis in the human enteroid model. Infect Immun. 87 (4), (2019).
  64. Nickerson, K. P., et al. A versatile human intestinal organoid-derived epithelial monolayer model for the study of enteric pathogens. Microbiol Spectr. 9 (1), 1-17 (2021).
  65. Perlman, M., Senger, S., Verma, S., Carey, J., Faherty, C. S. A foundational approach to culture and analyze malnourished organoids. Gut Microbes. 15 (2), 2248713 (2023).
  66. Pope, L. M., Reed, K. E., Payne, S. M. Increased protein secretion and adherence to HeLa cells by Shigella spp. following growth in the presence of bile salts. Infect Immun. 63 (9), 3642-3648 (1995).
  67. Faherty, C. S., et al. The synthesis of OspD3 (ShET2) in Shigella flexneri is independent of OspC1. Gut Microbes. 7 (6), 486-502 (2016).
  68. Ridlon, J. M., Kang, D. -J., Hylemon, P. B. Bile salt biotransformations by human intestinal bacteria. J Lipid Res. 47 (2), 241-259 (2006).
  69. Köseoğlu, V. K., Hall, C. P., Rodríguez-López, E. M., Agaisse, H. The Autotransporter IcsA promotes Shigella flexneri biofilm formation in the presence of bile salts. Infect Immun. 87 (7), 1-14 (2019).

Tags

Immunologi og infeksjon utgave 204 Shigella etterlevelse invasjon intracellulær replikasjon patogenese virulensfaktorer epitelceller gallsalter
Epitelcelleinfeksjonsanalyser med <em>Shigella</em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Poore, K., Lenneman, B. R., Faherty, … More

Poore, K., Lenneman, B. R., Faherty, C. S. Epithelial Cell Infection Analyses with Shigella. J. Vis. Exp. (204), e66426, doi:10.3791/66426 (2024).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter