본 프로토콜은 시험관 내 상피 세포주를 사용하여 Shigella 부착, 침습 및 세포 내 복제를 조사하기 위한 감염 분석을 설명합니다.
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방법 논문
Shigella를 사용한 상피 세포 감염 분석
* These authors contributed equally
이 논문에서
요약
초록
인간이 적응한 장내 세균 병원균 Shigella는 매년 수백만 건의 감염을 일으키고, 소아 환자들 사이에서 장기적인 성장 효과를 일으키며, 전 세계적으로 설사로 인한 사망의 주요 원인입니다. 감염은 병원체가 위장관을 통과하여 결장 내벽의 상피 세포를 감염시킨 결과로 물이나 피가 섞인 설사를 유발합니다. 항생제 내성이 급격히 증가하고 현재 승인된 백신이 부족하기 때문에 이 무시무시한 병원체를 연구하기 위해서는 표준화된 연구 프로토콜이 매우 중요합니다. 여기에서는 결장 상피 세포에서 박테리아 부착, 침습 및 세포 내 복제에 대한 시험관 내 분석을 사용하여 Shigella의 분자 발병 기전을 조사하는 방법론을 제시합니다. 감염 분석 이전에, Shigella 군집의 독성 표현형은 한천 플레이트에서 콩고 적색 염료의 흡수에 의해 확인되었습니다. 보충된 실험실 배지는 in vivo 조건을 모방하기 위해 박테리아 배양 중에 고려할 수도 있습니다. 그런 다음 박테리아 세포는 표준화된 프로토콜에서 조직 배양 플레이트의 결장 상피 세포를 확립된 다중성 감염에서 감염시키고 각 감염 단계를 분석하기 위한 적응을 통해 사용합니다. 부착 분석의 경우, Shigella 세포는 상피 세포와의 박테리아 접촉을 촉진하기 위해 감소된 배지 수준으로 배양됩니다. 침습 및 세포 내 복제 분석 모두에서 겐타마이신은 세포 외 박테리아를 제거하고 침입 평가 및/또는 세포 내 복제 속도의 정량화를 가능하게 하기 위해 다양한 시간 간격으로 적용됩니다. 모든 감염 프로토콜은 감염된 상피 세포 용해물을 연속적으로 희석하고 콩고 적색 한천 플레이트의 감염 역가와 관련된 박테리아 콜로니 형성 단위를 도금하여 부착, 침입 및/또는 세포 내 박테리아를 열거합니다. 이러한 프로토콜은 상피 세포의 이질균 감염의 각 단계에 대한 독립적인 특성 분석 및 비교를 통해 이 병원체를 성공적으로 연구할 수 있습니다.
서론
장내 세균성 병원체로 인한 설사병은 전 세계적으로 심각한 건강 부담입니다. 2016년 설사병은 전 세계적으로 130만 명의 사망을 초래했으며 1,2세 미만 5세 미만 어린이의 사망 원인 중 4위를 차지했습니다. 그람 음성, 장 세균성 병원균 Shigella는 전 세계적으로 설사로 인한 사망의 주요 원인인 이질증의 원인균입니다3. 이질균은 저소득 및 중간소득 국가의 아동에서 매년 상당한 이환율과 사망률을 유발하며4,5 고소득 국가의 감염은 탁아소, 식품 매개 및 수인성 발병과 관련이 있습니다6,7,8,9. 비효율적인 백신 개발10 및 항생제 내성(AMR)11,12
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프로토콜
1. 시약 및 재료의 준비
참고: 모든 부피는 두 개의 6웰 플레이트를 사용한 분석과 일치합니다.
- TSB 배지: 트립틱 대두 육수(TSB, 재료 표 참조) 배지 0.5g에 탈이온수(DI) 15L를 넣고 오토클레이브합니다. 실온에서 보관하십시오.
- 담즙염 배지(TSB + BS): 0.4%(w/v)의 담즙염을 함유하는 TSB를 제조하기 위해, 0.06g의 담즙염(BS, 재료표 참조)을 오토클레이브 TSB 15mL에 재현탁시킵니다. 0.22μm PES 필터를 사용하여 필터를 멸균합니다.
참고: 담즙염은 콜산나트륨과 데옥시콜산나트륨의 1:1 혼합물로 구성됩니다. 사용하기 직전에 새 용지를 준비하십시오. - DMEM + 10% (v/v) FBS: Dulbecco's Modified Eagle Medium(DMEM) 45mL에 소 태아 혈청(FBS) 5mL를 추가합니다. 4 °C에서 보관하십시오.
- DMEM + 겐타마이신: 50mL 튜브에 DMEM 50mL와 겐타마이신 50μL를 추가합니다( 재료 표 참조).
참고: 신선한 부분 표본을 만들고 각 실험 전에 3....
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결과
S. flexneri 2457T 야생형(WT)과 Shigella 독성을 부정적으로 조절하는 것으로 가정된 돌연변이인 S. flexneri ΔVF(ΔVF)를 비교하여 부착, 침습 및 세포 내 복제 분석을 수행했습니다. Shigella는 독성을 조절하기 위한 신호로 담즙염을 사용하기 때문에(17,18,47), TSB 배지 및 0.4%(w/v) 담즙염이 보충된 TSB에서 박테리아 부배양 후 실험을 수행하였다 18. 하위배양 단계 동안의 담즙염 노출은 대장 감염 이전의 소장 통과를 복제하기 위한 전처리로서 작용한다 17,18,47.
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토론
이 프로토콜은 장 상피 세포의 Shigella 부착, 침습 및 세포 내 복제를 연구하기 위한 세 가지 표준화된 분석 세트를 설명합니다. 이러한 방법은 숙주 세포 내에서 다양한 박테리아 병원체의 침입 및 세포 내 복제를 연구하는 데 사용되는 고전적인 겐타마이신 분석법의 수정된 버전일 뿐이지만(49,50,51), Shigella를 연구할 때 특별한 고려사항이 적용되어야 합니다.
Shigella는 통성 혐기성 세균으로, 폭기43이 있는 풍부한 배지에서 37°C에서 최적으로 자랍니다. Shigella 감염에 대한 다양한 환경 신호 또는 대사 산물의 영향을 조사하기 위해 이러한 분석을 수행할 때 Shigella.......
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공개 사항
저자는 이해 상충이 없음을 선언합니다.
감사의 글
저자에 대한 지원에는 매사추세츠 종합병원 소아과, 연구 중간 지원 기금 집행 위원회(ISF) 상 2022A009041, 국립 알레르기 및 전염병 연구소 보조금 R21AI146405, 국립 당뇨병 및 소화기 및 신장 질환 연구소 보조금 하버드 영양 비만 연구 센터(NORCH) 2P30DK040561-26이 포함됩니다. 연구비 지원자들은 연구 설계, 자료 수집 및 분석, 출판 결정, 원고 준비에 아무런 역할도 하지 않았다.
....액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 0.22 &무; m PES 필터 | Millipore-Sigma | SCGP00525 | 멸균, 최대 50mL 매체 멸균용 폴리에테르설폰 필터 |
| 14mL 배양 튜브 | Corning | 352059 | 17mm x 100mm 폴리프로필렌 테스트튜브(캡 포함 |
| 50mL 코니컬 튜브 | Corning | 430829 | 50mL 투명 폴리프로필렌 원추형 바닥 원심분리기 튜브(누출 방지 캡 포함) |
| 6웰 조직 배양 플레이트 | Corning | 3516 | 플레이트는 최적의 세포 부착을 위해 처리됩니다 |
| 담즙염 | Sigma-Aldrich | B8756 | 콜레이트와 데옥시콜레이트 1:1 비율 |
| 콩고 적색 염료 | Sigma-Aldrich | C6277 | 벤지딘 기반 음이온성 디아조 염료, >85% 순도 |
| Countess 세포 계수 챔버 슬라이드 | Invitrogen | C10283 | Countess 자동 세포 계수기 |
| 디메틸 설폭사이드(DMSO) | 와 함께 사용Sigma-Aldrich | D8418 | A, 고극성 유기 시약 |
| Dulbecco' s Modified Eagle Medium (DMEM) | Gibco | 10569-010 | DMEM에는 고포도당, 피루브산나트륨, GlutaMAX 및 페놀 적 |
| 색 태아 소 혈청(FBS) | Sigma-Aldrich | F4135 | 열 비활성화, 멸균 |
| 겐타마이신 | Sigma-Aldrich | G3632 | 재고 농도는 50mg/mL |
| HT-29 세포주 | ATCC | HTB-38 | 선암종 세포주; 결장직장 원산지 |
| 파라핀 필름 | Bemis | PM999 | 실험실 밀봉 필름 |
| 페트리 접시 | Thermo Fisher Scientific | FB0875713 | 100 mm x 15 mm 고체 매체용 페트리 접시 |
| 인산염 완충 식염수(PBS) | Thermo Fisher Scientific | 10010049 | 1x 농도; pH 7.4 |
| 한천 선택 | Invitrogen | 30391023 | 붉은 해조류 세포벽에서 추출한 다당류의 혼합물로 세균 도금 매체 |
| T75 플라스크 | Corning | 430641U | 조직 배양 플라스크 |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | 일반적인 비이온성 계면활성제 및 유화제 |
| Trypan blue stain | Invitrogen | T10282 | 죽은 조직 배양 세포를 검출하기 위한 염료; 살아있는 세포만이 염료를 제외할 수 있습니다 |
| Trypsin-EDTA | Gibco | 25200-056 | 세포주 유지 및 통과 분석을 위한 세포 해리용 시약 |
| Tryptic Soy Broth (TSB) | Sigma-Aldrich | T8907 | 박테리아 성장 배지 |
참고문헌
- Karambizi, N. U., McMahan, C. S., Blue, C. N., Temesvari, L. A. Global estimated Disability-Adjusted Life-Years (DALYs) of diarrheal diseases: A systematic analysis of data from 28 years of the global burden of disease study. PloS one. 16 (10), e0259077(2021).
- WHO.
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재인쇄 및 허가
