Summary
特注のマイクロドライブにより、リニアシリコンアレイで皮質記録部位をサブミリメートルでターゲティングすることができます。
Abstract
マーモセットモンキーは、皮質表面が滑らかであるため、層状皮質回路を調べるのに理想的なモデルであり、線形アレイによる記録が容易です。マーモセットは、他の霊長類と同様の神経機能構成と、記録とイメージングの技術的利点により、最近人気が高まっています。しかし、このモデルの神経生理学は、サイズが小さく、解剖学的ランドマークとしての回がないために、いくつかのユニークな課題を提起します。特注のマイクロドライブを使用することで、研究者はリニアアレイの配置をサブミリメートルの精度で操作し、記録日数にわたって同じ網膜異所を標的とした場所で確実に記録することができます。このプロトコルは、マイクロドライブ位置決めシステムの段階的な構築と、シリコン線形電極アレイによる神経生理学的記録技術について説明します。記録セッション全体で電極の配置を正確に制御することで、研究者は皮質を簡単に横断し、網膜の組織と記録されたニューロンのチューニング特性に基づいて関心のある領域を特定できます。また、この層状アレイ電極系を用いて、電流源密度分析(CSD)を適用し、個々のニューロンの記録深度を求めることができる。このプロトコルは、アレイ上の複数のチャネルにまたがるキロソートで分離されたスパイク波形を含む層流記録の例も示しています。
Introduction
コモンマーモセット(Callithrix jacchus)は、近年、脳機能を研究するためのモデルとして急速に人気が高まっています。この人気の高まりは、マーモセットの平滑皮質へのアクセスのしやすさ、神経機能構成がヒトや他の霊長類と類似していること、および小型で繁殖速度が速いことによるものです1。このモデル生物の人気が高まるにつれ、マーモセットの脳での使用に適した神経生理学的手法が急速に発展してきました。電気生理学法は、げっ歯類と霊長類の両方の皮質における単一のニューロンの活動を研究するために神経科学で広く使用されており、比類のない時間分解能と位置アクセスをもたらします。マーモセットモンキーは視覚神経科学のモデルとして比較的目新しいため、覚醒行動の電気生理学技術の最適化はまだ発展途上です。これまでの研究で、麻酔製剤における電気生理学の堅牢なプロトコルの確立が示され2、早期覚醒行動神経生理学の研究により、シングルチャネルタングステンエレクトードの信頼性が示されています3。近年、研究者たちは、覚醒行動神経生理学のためのシリコンベースの微小電極アレイの使用を確立しました4。しかし、マーモセットは脳のサイズが小さく、解剖学的ランドマークがないため、独自の標的設定の課題があります。このプロトコルは、組織の損傷を最小限に抑えながら、シリコン線形アレイでニューロンの大規模な集団の記録を可能にするマーモセットに適したマイクロドライブ記録システムを構築し、使用する方法を概説します。
マーモセットを扱うことは、大型の霊長類に比べて視覚野の網膜トピックマップのスケールが小さいため、課題を提起します。電極がわずか1mmずれるだけで、マップが大きく変化する可能性があります。さらに、研究者は、視覚野のより広い範囲の網膜領域位置を得るために、記録セッション間で電極の配置を変更する必要があることがよくあります。現在の半慢性的な製剤では、電極の位置決めを毎日調整したり、サブミリメートルスケールで特定の場所をターゲットにするのに十分な精度で調整したりすることはできません5。そこで、本提案するマイクロドライブシステムは、軽量なマイクロドライブを記録室に搭載したX-Y電極ステージを採用し、皮質部位をサブミリ単位で照準化することを可能にしました。可動式X-Yステージコンポーネントは、皮質領域を体系的に横断するために、リニアアレイの垂直および水平移動を可能にし、これは関心のある領域を特定するために(網膜トピーとチューニング特性を介して )必要です。また、記録セッション中に、研究者はX-Yステージを手動で調整して、エリア内のターゲットサイトを移動させることもできます。これは、電極ターゲティング機構が容易でない半慢性記録調製物を用いた代替技術に対する重要な利点です。
マイクロドライブは、皮質に下降させるためにさまざまなシリコンアレイを取り付けることができる汎用性の高いツールです。このプロトコルでは、200 μm間隔で配置された2つの32チャンネルリニアアレイを備えたカスタムプローブを使用して、皮質の深さにまたがる層流回路の調査を行いました。神経回路を調べるためのほとんどの方法は、通常、大脳皮質のすべての層で平均化された電位または単一単位をサンプリングします。しかし、最近の研究により、皮質層流微小回路に関する興味深い発見が明らかになりました6。マイクロドライブを利用することで、研究者は層流プローブを使用し、記録深度を微調整して、すべての層にわたる包括的なサンプリングを確保することができます。
このシステムは、市販のコンポーネントで構築でき、さまざまな実験手法やプローブに合わせて簡単に変更できます。この調製の主な利点は、X-Y記録位置をサブミリメートルの精度で変更できることと、皮質内の記録の深さを制御できることです。このプロトコルはX-Yの段階のマイクロドライブおよびneurophysiologyの記録の技術を組み立てるためのステップバイステップの指示を示す。
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Protocol
実験手順は、National Institutes of Health Guide for the Care and Use of Laboratory Animals(国立衛生研究所の実験動物のケアと使用に関するガイド)に従った。実験的および行動的手順のプロトコルは、ロチェスター大学の施設動物管理および使用委員会によって承認されました。
1. 記録用電極を内蔵したマイクロドライブの構成(図1)
注:マルチチャンネルリニアシリコンアレイを保持する特注のX-Yステージにより、記録部位のサブミリメートルのターゲット設定が可能です。
- 図1に概説されているすべてのマイクロドライブ部品を集めます。透明なアクリロニトリルブタジエンスチレン(ABS)プラスチックを使用して、カスタムパーツを3Dプリントします。これには、保護スリーブ、ベース、Xステージ、Yステージが含まれます。3D パーツの設計は、オンライン (https://marmolab.bcs.rochester.edu/resources.html) で入手できます。さらに、電極、プラスチック製の長方形のプラットフォーム、グリッド、マイクロマニピュレーター、スチールチューブ、および6本のステンレス鋼ネジ(ネジサイズ:00)を集めます。
- ダイヤモンドホイールカッティングアタッチメント付きの回転工具を使用して、プラスチックグリッドの4 mm x 3 mm x 3 mmの断面を1 mm x 1 mmの穴間隔で切り取ります。
- エポキシを使用して、小さな切り欠きグリッドセクションをYステージの上部に固定します。次に、マイクロドライブをそのグリッドにネジで取り付けます。安定性のためにベースにエポキシを追加します。
- 3Dプリントされた小さな長方形のプラットフォームを、エポキシ樹脂で28Gの鋼管に取り付けます。これは、シリコン電極を保持するための将来のステップで使用されます。
- 23Gのガイドチューブをグリッドに通します。次に、プラスチックプラットフォームに取り付けられた鋼管を23Gガイドチューブに通します。28 G のスチールチューブをマイクロドライブのスロットの 1 つに挿入します。
- 次に、ステンレス鋼の六角ネジ(サイズ:00、長さ:1/8インチ)を使用して3Dパーツ(ベース、Xステージ、Yステージ)を組み立て、ドライブのベースを構築します。
- まず、手で叩く工具を使用して、ベースとXステージの両方にあらかじめ用意されているネジ穴を軽くたたきます。次に、Xステージの長いスロットに4本のネジを挿入し、ベースにあらかじめ作られた対応するネジ穴に固定することから始めます。
- 可動式のXステージをベースに固定したら、Yステージの長いスロットに2本のネジを挿入し、Xステージの既製のネジ穴に固定します。
注意: XステージとYステージは、ネジが完全に締められるまで移動可能なままにする必要があります。
- マイクロマニピュレータードライブに、電極コネクタを取り付けるためのプラスチック製のプラットフォームと、電極を保持するための延長ポリイミドチューブが装備されていることを確認してください。64ピンコネクタをマイクロマニピュレーターのプラットフォームにテープで取り付けます。
- マイクロマニピュレーターのプラスチックチューブにバシトラシン(滅菌軟膏)を慎重に置き、フレキシブルリボンケーブル を介して 64ピンコネクタに接続された電極を取り付けます。
- マイクロマニピュレータードライブを使用して、シリコン電極とそのコネクタを保持し、プラスチックチューブをYステージの穴に通します。電極はプローブのステージの下に吊り下げられ、プラスチック製の長方形のプラットフォームに取り付けられるのを待ちます(ステップ7、セクション1)。
- マイクロマニピュレータードライブから64ピンコネクタを取り外し、接着剤ジェルを使用してコネクタをXステージのプラットフォームに固定します。接着剤がコネクタを所定の位置に保持した後、コネクタの接着を強化するために、追加のエポキシを追加できます。一晩放置して乾かします。
- プラスチックチューブから電極を慎重に取り外し、マイクロマニピュレータードライブをアセンブリから取り外します。
注意: この時点では、ドライブはヘルピングハンズのワニ口クリップでのみ保持されており、電極はドライブ構造内に固定されていません。 - ワニ口クリップを慎重に動かしてドライブを裏返し、固定されていない電極を確認します。先端鈍鉗子を使用して、電極をYステージの下のプラスチックホルダーに置き、少量のシリコンエラストマー(シラスチック)で固定します。接着剤が硬化するまで5分間待ちます。
- マイクロドライブのネジコントロールを使用して、電極を引っ込めます。
- マイクロドライブの電極の上に保護スリーブを置きます。この保護スリーブは、カスタム印刷された記録チャンバーと同じサイズで、ドライブアセンブリのベースにしっかりと収まります。
- マイナスドライバを使用して、マイクロドライブのベースコンポーネントの側面にある 3 本のネジを締め、保護スリーブを所定の位置に固定します。録音に使用するヘッドステージを64ピンコネクタに接続します。
2. 全体のインピーダンスを低減するための電極の多角形めっき (図2)
注:最高の記録品質を得るには、シリコン電極アレイをポリ(3,4-エチレンジオキシチオフェン)溶液(PEDOT)で電極めっきすると便利です。この方法は、信号対雑音比を増加させることが示されている7,8。
- PEDOT溶液を調製するには、0.075 mLの3,4-エチレンジオキシチオフェン(EDOT)と1.4 gのポリ(4-スチレンスルホン酸ナトリウム)(PSS)を70 mLの蒸留水に混ぜ合わせます。この溶液を短時間ボルテックスして、成分が完全に溶解するようにします。使用前日にこの溶液を混合すると、最適な溶解が得られます。
- インピーダンステスターソフトウェア(材料表を参照)を起動した後、選択した電極の準備で設定を準備します。ソフトウェア ウィンドウの左上にある上部のドロップダウン メニューを使用して、使用するアダプタ(N2T A32)を選択します。2番目のドロップダウンメニューを使用して、使用する電極(NLX-EIB-36)を選択します。電極がプルダウンメニューにリストされていない場合は、新しい電極の定義方法についてマニュアルを参照してください。チャネル数が正しいことを確認します。
- プローブをコネクタ を介して インピーダンステスターシステムに接続し、プローブを接地された生理食塩水に下げてベースラインの読み取り値を取得します。
- インピーダンステスターシステムで、左側の[ インピーダンスのテスト ]ボタンを押し、正しい設定(設定: テスト周波数:1,004 Hz、 サイクル:100、 一時停止:0)を確認します。 次に、右下の テストプローブ ボタンを押します。
- インピーダンステスターを実行すると、プローブレポートウィンドウが表示され、結果がスプレッドシートに保存されます。電極の両方のシャンクの将来の参照のために、これらの結果を保存してください(インピーダンステスターで使用するためのビーカーへの電極の取り付けは 、図2Dに示されています)。複数のシャンクを持つプローブを使用する場合は、シャンクごとに手順3を繰り返してください。
- ビーカーを保持している台座(つまり、ラボジャック)を下げて、生理食塩水からプローブを取り外します。ビーカー液を蒸留水と交換します。ラボジャックを上げて電極を沈め、残りの生理食塩水を洗い流してから、ラボジャックを再度下げます。
- ビーカー内の蒸留水をPEDOT溶液と交換し、電極が溶液に浸かるまでラボジャックを上げます。
- ソフトウェアウィンドウの左側にある [DC Electroplate ]ボタンを選択し、正しい設定が使用されていることを確認します(設定: Autoplate:0.004 μA、350 Hz、 Duration:5、Pause:1)。 次に、右下の Autoplate ボタンを押します。もう一度、プローブレポートウィンドウが表示され、電気めっきの結果が表示されます。後で参照できるように、これらの結果を保存します。複数のシャンクを持つプローブを使用する場合は、シャンクごとにこの手順を繰り返してください。
- ラボジャックを下げてPEDOT溶液からプローブを取り出し、前に実行したようにプローブを蒸留水ですすぎます(ステップ4)。すすぎ後、ビーカーに生理食塩水を入れ、電極が水没するまでラボジャックを上げます。
- ソフトウェアウィンドウの左側にある [Test Impedances](インピーダンスのテスト )ボタンを押して、正しい設定が使用されていることを確認します(設定: テスト周波数:1,004 Hz、 サイクル:100、 一時停止:0)。 右下の Test Probe(プローブのテスト )ボタンを押します。後で参照できるように、これらの結果を保存します。複数のシャンクを持つプローブを使用する場合は、シャンクごとにこの手順を繰り返してください。
注意: 電気めっき後の値と電気めっき前の値を比較してください。インピーダンス値が減少するはずです。 - 継続的に使用すると、プローブは6か月後にインピーダンス値の増加を示す場合があります。記録信号のインピーダンス値に懸念がある場合は、手順3に従ってプローブのインピーダンスを再テストします。インピーダンス値が初期値から増加した場合は、電気めっきを繰り返します(ステップ6)。
3.ヘッドキャップ、チャンバー、および開頭術の外科的配置(図3A-C)
注:この研究では、研究の終了時に、動物はイソフルランの下で麻酔され、ケタミンの筋肉内(IM)注射を受け、続いてユータゾールの腹腔内(IP)注射を受けました。生理食塩水とそれに続く10%ホルマリンによる経心灌流に続いて脳を摘出しました。
- マーモセット(1.5歳以上)を訓練して、手術の3、9、10、11 の2か月前に、前述の方法に従って小さな霊長類の椅子に座らせます。
- 手術当日に、ケタミン (5-15 mg/kg)/デキストドーミトール (0.02-0.1 mg/kg) の筋肉内注射 (および筋弛緩薬として 0.25 mg/kg のミダゾラム) を被験者に誘導し、心拍数、呼吸、つま先のつまみ反射に基づいて適切な麻酔を確認します。動物のバイタルを監視しながら、手術中、イソフルラン(100%酸素中の0.5%〜2%)を連続投与するために動物を挿管します。麻酔中の乾燥を防ぐために、手術中に目に獣医の軟膏を使用してください。
- 外科医が滅菌PPEを着用した後、滅菌ドレープを使用して表面と手術野を覆う無菌手術野を準備します。無菌技術を使用して、外科医にチタン製の支柱とネジを備えたアクリル製のヘッドキャップを埋め込んで、Nummelaらによって以前に詳細に説明された方法を使用して頭を安定させます11。
- インプラント手術中は、脳定位固定座標12に基づいて、関心のある領域(例えば、視覚領域、中側頭野[MT]、および一次視覚野[V1])に対する記録チャンバーの配置を計画します。
- アース線を配置します。
- まず、予定された記録チャンバーの領域近くの頭蓋骨に1.1mmのバリ穴を開けます。36Gのステンレス鋼線を先端から約0.075〜1mm曲げ、ワイヤーの曲がった部分をバリ穴の底にある頭蓋骨と硬膜の間にスライドさせます。
- チャンバーを配置するときは、最初にワイヤーと穴を骨ワックスで密閉し、次にセメントとアクリルで密閉します。チャンバーの近くには、接地用に取り付ける部分を残してください。
- 記録部位とアース線の全領域を覆うように速接着セメントの下地層を配置した後、速接着セメントを使用して記録チャンバー(カスタム3Dプリント部品で構成)を頭蓋骨に接着し、頭部インプラントを構築するときにアクリルで補強します。
- チャンバー内にしっかりと収まるように設計された3Dプリントチャンバーキャップでチャンバーを密閉します(対象とペアで収容されたケージメイトでは取り外せません)。
- 付属のミキシングチップを使用してチャンバーの内縁に少量のシリコンエラストマー(シラスティック)を塗布し、チャンバーの外側の壁と同じ高さになるまでチャンバーキャップを挿入します。
- チャンバーは、チャンバーキャップを簡単に取り外せるように、チャンバーの両側にアクセス穴(直径1mm)があるように設計されています。これらのアクセスホールをシールするためにsilasticを使用し、気密チャンバーシールを実現します。
注意: チャンバーキャップを取り外すには、ピンセットを使用してアクセスホールのシリコンシールを最初に取り外し、チャンバーの気密シールを破ります。次に、ピンを使用してチャンバーキャップをチャンバーから取り出すことができます。
- 動物を麻酔から回復させ、胸骨横臥を維持するのに十分な意識を取り戻すまで放置しないでください。動物を手術後、抗生物質(13.75 mg / kgのアモキシシリン-クラブラン酸)で7日間、抗炎症薬(0.1 mg / kgのメロキシカム)で3日間治療します。回復前に徐放性鎮痛剤を投与し、術後72時間持続させ、完全に回復するまで動物を独立して飼育します。
- 手術後2〜3週間で、ヘッドレストと視覚行動のトレーニングを開始します。マーモセットを霊長類の椅子に置き、ヘッドレストに順応させます。快適になったら、中心視固定13や、視力の測定に使用される末梢で検出されたガボールグレーチング11へのサッカードタスクなど、いくつかの基本的なタスクを実行するようにマーモセットを訓練します。
- 十分な行動訓練の後、記録室内で開頭術を行います。無菌技術の下で、2回目の手術を実施して、関心のある領域(例:MT領域)の記録チャンバーで開頭術(直径2〜3 mm)を作成します。.脳を感染から保護し、肉芽の成長を抑えるために、約1mmの珪膜または開頭術の深さの厚い塗布で開頭術を密封します14。シラスティックシールのエッジが、すべての側面で少なくとも2mm以上の歯科用セメントにつかまっていることを確認してください。手順7の説明に従ってチャンバーキャップを元に戻します。
- 手術後数日で出血が発生した場合、またはシラスティックシールから透明な液体が漏れた場合は、チャンバーを洗浄する必要があります。
- シラスティックシールが無傷の場合は、滅菌技術を使用して10%ベタジンで洗浄し、シールを取り外す前に滅菌生理食塩水で洗浄します。シラスティックシールが無傷でない場合は、滅菌技術の下で滅菌生理食塩水でのみ洗浄してください。
- シラスティックが除去されたら、滅菌生理食塩水で硬膜を数回洗い流し、綿チップアプリケーターで乾かします。綿の先端アプリケーターを使用してチャンバーを完全に乾燥させてから、新しいシラスティックの層を塗布します。通常、チャンバーは安定し、数日から1週間後にしっかりと密閉された状態で乾燥した状態を保ちます。
- 開頭術が安定し、出血の兆候が見られなくなったら、硬膜擦り傷を実行して硬膜の余分な組織を取り除きます。次に、シラスティックの薄い層(<1 mm)を塗布し(記録用の電極を通過できるほど薄い)、1/4バリドリルビットを使用して、 図3Cに示すように、開頭術の壁の上にシラスティックを吸い上げて機械的に購入します。
注意: これにより、クリーニング目的で簡単に取り外すこともできます。シラスティックは、研究期間中は所定の位置に留まることができ、記録のためにリニアアレイ電極で穴を開けることができます。
4.神経生理学の記録設定(図3D-F)
注:動物の取り扱い手順は、ラボや実験によって異なります。次の手順は、マイクロドライブの配置と記録用の硬膜の貫通に固有です。
- 記録チャンバーからキャップを取り外します(セクション3、ステップ7.2で説明)。キャップを91%イソプロピルアルコールに入れて、録音中に浸します。チャンバーの端がシラスティックから取り除かれていることを確認してください。チャンバーの端にシリコンが残っていると、マイクロドライブが正しく取り付けられません。
- マイクロドライブのベースには、動物のチャンバーに締め付けるための3本のネジがあります。通常、これらのネジはチャンバーと同じサイズの保護スリーブの周囲で締め付けられ、内部のシリコンプローブが当たらないように保護されます。
- まず、ドライバーを使用して、シリコンプローブの保護スリーブを固定している3本のネジを緩め、スリーブを慎重に取り外します。マイクロドライブを記録チャンバーに取り付け、チャンバーの壁にあるシリコン電極に当たらないように注意します(図3D、E)。
- さらに、ドライブをチャンバーに配置する前に、電極が完全に格納された位置にあることを確認し、最初の配置時にコルテックスの十分に上に位置するようにします。
- 取り付けたら、ドライバを使用してマイクロドライブの側面にある各ネジを締めます(図3F)。ネジを締める順序を選択し、その場所の安定性を維持するために毎回これを使用します。研究者は、最初にネジを緩めて同じ量だけ締めるときの回転数を数えることもできます。プローブが緩んでいないか確認し、必要に応じて締めますが、締めすぎてプラスチックのネジ山を剥がさないように注意してください。
- マイクロドライブをチャンバーに固定したら、必要なアース線をすべて配置します。
注意: ヘッドステージを動物に装着した状態ではヘッドステージをコネクタに挿入するのは難しいため、ヘッドステージをコネクタに挿入することは難しいため、ヘッドステージをコネクタに一晩挿入したままにしておきます。 - SPIケーブルをヘッドステージ(すでにプローブに接続されている)に慎重に差し込みます。ワイヤーを曲げないように注意してください。Open-Ephys GUI(https://github.com/open-ephs/plugin-GUI)を使用して、ヘッドステージからのすべての神経生理学的データを30kHzで増幅し、デジタル化します。ヘッドステージからの広帯域信号を0.1Hzでハイパスフィルタリングし、前述のように、このフィルタリングによる位相シフトを補正します15。線形配列の場合は、共通平均参照によって結果のトレースを前処理します。
- 記録システムで使用されている特定の電極アレイのチャンネルマップを入力して、記録中にプロットされたチャンネルがハイパスフィルターされた記録信号ビューで深度順に並べられるようにします。このビューは、電極を進退させるときに利用されます。
5. 神経生理学記録実験の実施(図4)
注:ここでは、電極アレイを皮質に下げる方法が説明されています。この方法は、下にある組織の過度のくぼみを避けるために最適化されています。電気生理学的記録におけるノイズの増加は、珪膜を貫通して脳に入る前にくぼみが形成されていることを示す良い兆候である。いったん脳に入ると、くぼみが多すぎると、研究者はドライブを操作しなくてもプローブ上でユニットが移動していることに気付くかもしれません(ユニットはチャネルを徐々に深く移動します)、あるいは、研究者は、特にプローブの表面部位で、神経活動の抑制に気付くかもしれません。このような状況では、ドライブを格納してディンプルを緩和し、より良い録音を容易にします。
- マイクロドライブのネジコントロールを使用して、シリコンプローブを下げ、アレイの先端でユニットが観察されるまで、1〜2秒ごとに1回転(250μm)します。
注意: 硬膜の上に置かれた珪膜の浸透中にノイズのわずかな増加が観察される場合があります。.シャンクは飛び出す前にシラスティックをくぼませ、プローブのノイズを増加させる可能性があります。ユニットの最初の兆候がシラスティック層の浸透を助けるまで、高速降下します。 - 最初のニューロンが観察されたら、マイクロドライブ(250μm)を1回転後退させて、電極が珪膜と硬膜を通って皮質組織に飛び出し始めると、侵入速度を下げます。電極がマイクロマニピュレーションなしで時間の経過とともに組織内に進み続けるように見える場合は、さらに回転を引っ込めて、シリコンとその下の組織を押すプローブからの圧力を和らげます。
注:線形アレイの正しいチャネルマップがロードされていれば、ニューロンの位置を追跡できるはずです(チャネルは、皮質に対する深さの順に並べて表示されます)。 - ニューロンがプローブの長さ全体に均等に分布するまで、20〜30分間にわたって約4〜6回転(1〜1.5 mm)ずつ前進しながら、アレイを皮質に非常にゆっくりと駆動し続けます。
- アレイをゆっくりと1〜2回転(0.25〜0.5 mm)引っ込めて、組織への圧力を下げてから記録を開始します。
注:ニューロンは通常、この収縮中に線形アレイ上のチャネル位置をシフトしないため、主に組織への圧力を軽減するように作用することを示唆しています。収縮しないと、記録中に組織が弛緩するにつれて連続的なアレイシフトが見られ、記録の安定性が損なわれる可能性があります(図4C)。 - 引っ込めた後、20分待ってから録音を開始します。これにより、記録に表示される動きの量が制限されます。この時間を使って、記録の準備をします(つまり、アイトラッキングのキャリブレーションと刺激提示システムの準備)。
- 録音ソフトウェアで [録音 ]を選択します。
- 実験が完了したら、もう一度記録ボタンを選択します。これにより、選択した宛先に完全な録音ファイルが作成されます。続行する前に、ファイルが正しく保存されていることを確認してください。
- 以前と同様の速度でアレイを皮質からゆっくりと引き抜き始めます(20〜30分間で4〜6回転)。ニューロンがプローブに沿って移動するのを観察して、プローブが後退する様子を視覚化します。最初にニューロンを見てから回転数だけ後退した後、プローブ上にニューロンが観察されなくなったら、完全に格納された開始位置に戻るまで、より迅速に後退し続けます。
- プローブを記録チャンバーから取り外すには、セクション4のステップ1〜3を逆の順序で実行します(つまり、最初にステップ3を実行し、次にステップ2を実行し、次にステップ1を実行します)。
- プローブを記録チャンバーから取り出したら、コンタクトレンズ溶液に20分間浸して、電極から組織や血液を取り除きます。その後、プローブをアルコールに1分間入れてコンタクトレンズ溶液を取り除き、電極を乾かします。
- Kilosort2 を使用して、記録システムからの初期フィルター処理後に配列データをスパイクソートします (セクション 4、手順 5 で前述)。
- "phy" GUI (https://github/kwikteam/phy) を使用して、スパイク ソート アルゴリズムからの出力に手動でラベルを付けます。小さな波形や生理学的に信じがたい波形を持つ単位をノイズとして分類し、除外します。
- 層流プローブを使用する場合は、各チャンネルのスパイク波形を表示して、チャンネル上の1つのユニットにピーク波形のラベルが付けられていることを確認します(図5A)。PCA 空間に明確なクラスターがあり、スパイク間間隔違反が 1% 未満、および二相性スパイク波形 (線形アレイ上の隣接チャンネルに局在化する必要がある) を持つユニットのみを含めます。 図5Bには、PCA空間のクリアなクラスター(右上)と経時的な安定性(右下)を示す単一ユニットの例が示されています。
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Representative Results
このプロトコルでは、サブミリメートルの部位ターゲティングを可能にし、個別の記録セッション間で信頼性の高いポジショニングを維持するX-Y電極ステージ(図1)を構築する方法について説明します。X-Y測位の信頼性を 図6に示し、1週間間隔で実施した2つの録音セッションで、平均RF位置が70.8%重複していることを示しています(図6A)。さらに、マイクロドライブの位置を微調整することで、網膜領域での正確な動きをサポートすることができます。最大0.2mmのXステージとYステージの小さな動きは、2mm離れた各ステージにあらかじめ開けられた穴を参照することで行うことができます。わずかな位置調整でMT/MTCの境界を越える一連の記録セッション(図6B)では、網膜空間での正確な動きが見られました(図6C)。MTとMTCの記録部位は、ソロモンとローザ2号で以前に描かれた電気生理学マップと一致していました。同様に、このプロトコルでは、Z位置決めは、好ましい電極深さまでの巻数によって追跡することができる。皮質の深さに電極を配置するためのドライブのZ位置決めは、毎日調整する必要があり、多少のばらつきを伴いますが、前述のように、電流源密度分析(CSD)を使用して、オフラインで早期の視覚領域の深さの推定値を取得することが可能です16。
このX-Yステージ技術を使用すると、研究者は線形アレイで神経生理学的記録を実行し、被験者は視覚受容野マッピングと単純なサッカードタスクのためのさまざまな採餌タスクを実行できます17。電極の留置技術を 図4に示し、組織への圧力を緩和し、長期的な皮質損傷を防ぐための収縮の重要性を強調しています。2つのシャンクリニアアレイを使用すると、各記録中に皮質の深さにわたって多数のニューロンをサンプリングできます。この研究では、Kilosortを使用して得られたスパイクソートアレイデータから、クラスター内の選択されたスパイクの主要な構成要素の特徴がバックグラウンドスパイクとは区別され、記録が経時的に安定していることが示されました(図5)。
図1:電極マイクロドライブの構造。 電極マイクロドライブの構築は、セクション1、ステップ1でレイアウトされたすべての必要なコンポーネントを取得した後に可能です。連続する各ステップ(セクション1、ステップ2〜10)には、必要なアクションの視覚化に役立つ変更前と変更後の画像が表示されます。この構造については、プロトコルセクション1で詳しく説明しています。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
図2:マイクロドライブと電気めっきのセットアップを構築しました。完成したマイクロドライブを上面から、(B)下面から見た概観画像。(C)マイクロドライブは、保護スリーブ(動物のインプラントのチャンバーと同じ寸法で、保護のために長さが延長されている)に取り付けられ、3本のサイドネジを締めて動物のチャンバーに取り付けられます。(D)電気めっき用インピーダンステスター上のマイクロドライブの構成。この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
図3:ヘッドキャップとチャンバー配置の概略図 (A)ヘッドキャップ、ヘッドポスト、およびMTチャンバーを備えた動物の図面表現。(B)開頭術から6か月後、珪膜の薄層で密封されたMTチャンバーの画像。(C)チャンバーとマイクロドライブの準備の概略図。この図は、チャンバーの準備と、録音に使用するためのシラスティックの薄い層を示しています。マイクロドライブは、側面のネジからの張力によって記録室に固定されます。(D)マイクロドライブを記録室に取り付けるには、チャンバーと平行に移動する必要があります。斜めから来ると、チャンバーの側面や開頭手術のセメント側にぶつかる可能性があります。(E)マイクロドライブをヘッドキャップの例に固定したもの。(F) マイクロドライブの 3 本のネジをしっかりと締めて固定する図。注:1本のネジはコネクタの後ろにあり、通常は上から締めます。ネジは繰り返し可能な順序で締め付けられ、ドライブ位置の信頼性が確保されます。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
図4:神経生理学の記録 (A)硬膜に接触する前後の電極の描写(上)。プローブが硬膜に触れる前後の神経記録における単一のプローブからのハイパスフィルター処理された記録信号(下)。(B)電極が最初にシラスティックを突き破った後、くぼみを引き起こしている描写(上)。プローブがシラスティックを通過した後のニューラル記録における1つのプローブからのハイパスフィルタリングされた記録信号(下)。ニューロンを持つチャネルは、塗りつぶされたチャネルとしてラベル付けされます。(C)後退前後の皮質内の電極の描写(上)。500μmの収縮前後の神経記録における1つのプローブからのハイパスフィルター記録信号;ユニットは1チャンネル(下)シフトしました。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
図5:神経生理学データの後処理。 (A)層流プローブ(左)と各チャンネルで見たスパイク波形(右)。(B) キロソートの出力例。(写真左)複数のチャンネルにわたる波形の例と、チャンネル46のピーク波形(右上)一連の背景スパイクに対する、選択したクラスター内のスパイクの選択 (青) の主なコンポーネントの特徴 (記録全体で時間的に等間隔に配置された灰色)。スパイク クラスターは、バックグラウンド スパイクと簡単に区別できます。(右下)選択したクラスターに属する選択範囲のスパイクの振幅を経時的に変化させます。記録は、この例のニューロンの経時的な安定性を示しています。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
図6:X-Yステージポジショニングの信頼性 (A) 同じマイクロドライブ座標で1週間間隔をあけた2つの記録セッションの平均受容野(RF)等高線は、70.8%のオーバーラップを示しています。(B) 記録セッション間で連続するターゲティング場所を示すMT/MTCマップ。実線と数字は、中心窩からの離心率を度数で示しています。破線は水平子午線 (HM) を示します。太字の線は、鉛直子午線 (VM) を示しています。(C)中心位置を示す円で囲まれた各シャンクの対応するRF位置は、マイクロドライブの位置をわずかに調整することで、網膜領域での正確な動きをサポートできることを示しています。パネルBは、ソロモンとローザ2の許可を得て改変されています。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
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Discussion
現在、ヒト以外の霊長類で神経生理学実験を行うために、いくつかの方法(例えば、慢性、半慢性、急性)が利用可能である。一般的なマーモセットは、サイズが小さく、解剖学的ランドマークとしての回がないため、神経生理学実験に独自の課題をもたらします。このため、研究者は網膜形成や関心領域のチューニング特性などの神経生理学的ランドマークを使用して、記録ターゲットを特定する必要があります。したがって、皮質領域を最初にマッピングする場合、電極の位置を毎日調整する必要がある場合があります。マーモセット神経生理学の現在の調製物では、セミコンシカルなプローブポジショニングが用いられることが多く、簡単にアクセスできるポジショニングメカニズムは実現していません5。このプロトコルは、安定したリニアアレイ記録のための軽量マイクロドライブを実証し、チャンバー内の網膜をマッピングするために、セッション間で正確なサブミリ波の動きによる柔軟な位置決めを可能にします。
現在のアプローチは、正確な電極の標的化と網膜マップ全体の移動のために毎日急性の電極穿刺を行うもので、マーモセットの慢性電極アレイインプラントとは異なります5。しかし、急性期製剤には、実験準備時間が長くなり、感染のリスクが高まるだけでなく、挿入を繰り返すことによる皮質組織損傷のリスクが高まるなどの欠点があります。この製剤では、感染のリスクを抑えるためにシラスティックの使用が最適化されていますが、シラスティックを塗布するには、正しく行われ、ドライシールを得るためにいくつかのトラブルシューティングが必要です。また、この準備では、ドライブの取り付け時に電極が損傷しないように注意し、セッション全体で確実にターゲットを絞るためにドライブネジを締める際にも注意が必要です。
長期的な皮質損傷は、安全なドライブ、組織のゆっくりとした浸透、および主要な血管の回避により正しく適用された場合、この製剤で回避できます。さらに、感染を防ぐための開頭術での珪膜の使用は、この技術で最適化されています。開頭術が行われた後、脳は珪酸の薄い層で覆われ、感染を防ぎ、チャンバーの内部を乾燥した状態に保ちます14。硬膜が血液や肉芽組織から透明になると(これはタイトなシラスティックシールで可能)、これにより、下にある組織の主要な血管を視覚化し、記録中に血管に当たらないようにシリコンプローブをターゲットにすることができます。この手法では、シリコンシールが中央が薄く(<1mm)、過度のディンプルなしで電極を貫通できるようにすると同時に、機械的に購入するためにエッジが厚くすることが重要であるため、学習中にトラブルシューティングが必要です。これらの方法は、マーモセット皮質を横切る層の回路の役割を調査し、複数回の貫通中の組織損傷を防ぐ上で有用です。
このマイクロドライブ設計は、カスタムプリントされたプラスチック部品と市販の消耗品を使用しており、製造後は使いやすく、さまざまな記録プローブ用にパーソナライズできます。この方法は信頼性が高いことが示されていますが、最初の製造は習得が困難でコストがかかる可能性があります。しかし、プローブの部品は比較的経済的に購入でき、一度組み立てると、プローブは継続的に使用することで最大1年間持続することが示されています。
この試料作製の主な利点の1つは、X-Yステージによる関心領域の正確で再現性のあるターゲティングです。この技術により、研究者は記録チャンバー内の網膜トピックの位置をマッピングし、座標系を使用してさまざまな領域から日にわたって記録することができます。これを実現するには、プローブを毎日正しく配置し、すべての外部ネジを繰り返し締めることが重要です。外側のネジの締まり具合が変わると、電極の配置が数日でわずかに変化する可能性があります。
急性記録は、独立した測定を繰り返すという利点があり、単一ユニットデータの収率を高めることができます。ただし、半慢性または慢性的な録音にも利点がある場合があります。マウスなどの小動物では、高密度シリコンプローブを用いて慢性的な記録を行い、数日間にわたって安定した長期の集団記録を得ることができる18。記録セッションごとに脳に電極を繰り返し挿入する必要がなくなるため、実験全体の準備時間が短縮され、感染や皮質組織の損傷のリスクが軽減されます。したがって、慢性または急性の記録調製物の使用を評価する際には、特定の実験要件を考慮することが不可欠です。
提案されたマイクロドライブ設計は、さまざまな記録技術やアレイの使用に柔軟性を持たせることができるため、既存の実験セットアップやパイプラインに簡単に採用できます。さらに、マイクロドライブへのアレイマウントの柔軟性は、光遺伝学的な目的でレーザー刺激を制御するなど、将来のアプリケーションの可能性につながる可能性があります。この方法により、今後の研究でマーモセットにおけるレーザー刺激の標的化が改善される可能性がある。
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Disclosures
著者は何も開示していません。
Acknowledgments
この研究は、米国国立衛生研究所(NIH)の助成金R01 EY030998(J.F.M.、A.B.、およびS.C.)の支援を受けました。この方法は、Coop et al. (under review, 2022; https://www.biorxiv.org/content/10.1101/2022.10.11.511827v2.abstract) で開発された方法に基づいています。マーモセットの手入れと取り扱いを手伝ってくれたディナ・グラフとミッチェル研究室のメンバーに感謝します。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1/4 Hp burr drill bit | McMaster & Carr | Cat# 43035A32 | Carbide Bur with 1/4" Shank Diameter, Rounded Cylinder Head, trade Number SC-1, single Cut(https://www.mcmaster.com/products/bur-bits/burs-7/?s=1%2F4%22+bur+bits) |
| 1x1mm Crist Grid | Crist Instruments | 1 mm x 1 mm Grid | https://www.cristinstrument.com/products/implant-intro/grids |
| 91% isopropyl alcohol | Medline | N/A | https://www.medline.com/product/Medline-Isopropyl-Rubbing-Alcohol/Bulk-Alcohol/Z05-PF03807?question=91%25%20isopropyl%20alcohol |
| Acquisition Board | Open-Ephys | N/A | https://open-ephys.org/acquisition-system/eux9baf6a5s8tid06hk1mw5aafjdz1 |
| Bacitracin Ointment | Medline: Cosette Pharmaceuticals Inc | N/A | https://www.medline.com/product/Bacitracin-Ointment/Antibiotics/Z05-PF86957?question=bacitr |
| Blunt straight Forceps | Medline | N/A | https://www.medline.com/category/Central-Sterile/Surgical-Instruments/Forceps/Z05-CA16_02_20/products |
| Bone wax | Medline | ETHW31G | https://www.medline.com/product/Ethicon-Bone-Wax/Bone-Wax/Z05-PF61528?question=bonewax |
| C&B Metabond Quick Adhesive Cement System | Parkell, Inc. | SKU: S380 | https://www.parkell.com/C-B-Metabond-Quick-Adhesive-Cement-System |
| Clavamox | MWI Animal Health | N/A | |
| Contact lens solution | Bausch and lomb | Various sources available | |
| Custom Printed 3D printed parts | ProtoLab | https://marmolab.bcs.rochester.edu/resources.html | |
| DB25-G2 25 Pin Male Plug Port Signal Connector | Various Sources | DB25-G2 25 | DB25-G2 25 Pin Male Plug Port Signal 2 Row Terminal Breakout Board Screw Nut Connector |
| diamond saw attachment for dremel | Dremel | 545 Diamond Wheel | https://www.dremel.com/us/en/p/545-26150545ab |
| Digitizing Head-stages | Intan | RHD 32channel (Part #C3314) | https://intantech.com/RHD_headstages.html?tabSelect=RHD32ch&yPos=120.80 000305175781 |
| EDOT | Sigma Aldrich | Product # 483028 | https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/aldrich/483028 |
| Helping Hands | Harbor Freight | N/A | https://www.harborfreight.com/helping-hands-60501.html |
| Hook Electrical Clips | Various Sources | N/A | Hook test Cable wires |
| Interface Cables (RHD 3-ft (0.9 m) ultra thin SPI cable) | Intan | Part #C3213 | https://intantech.com/RHD_SPI_cables.html |
| Lab jack | Various Sources | N/A | https://www.amazon.com/Stainless-Steel-Scissor-Stand-Platform/dp/B07T8FM85H/ref=asc_df_B07T8FM85H/?tag=&linkCode=df0&hvadid=366343 827267&hvpos=&hvnetw=g&hvrand =2036619536500717246&hvpone =&hvptwo=&hvqmt=&hvdev=c&hv dvcmdl=&hvlocint=&hvlocphy=900 5674&hvtargid=pla-795933567991& ref=&adgrpid=71496544770&th=1 |
| Meloxicam | MWI Animal Health | N/A | |
| Micro-drive | Crist Instrument | 3-NRMD | https://www.cristinstrument.com/products/microdrives/miniature-microdrive-3-nrmd |
| Multi-channel linear silicon arrays with 64 channel connector | NeuroNexus | A1x32-5mm-25-177 | https://www.neuronexus.com/products/electrode-arrays/up-to-10-mm-depth/ |
| NanoZ Omentics Adapter- 32 Channel | NeuraLynx | ADPT-NZ-N2T-32 | https://neuralynx.com/hardware/adpt-nz-n2t-32 |
| NanoZ System | Plexon | NanoZ Impedance Tester | https://plexon.com/products/nanoz-impedance-tester/ |
| Narishige Micromanipulator | Narishige | Stereotaxic Micromanipulator | https://usa.narishige-group.com/ |
| Open-Ephys GUI | Open-Ephys | https://open-ephys.org/ | |
| Polyimide Tubing (OD(in): 0.021 / ID(in) 0.018 ) | Various Sources (Chamfr) | Chamfr Cat#HPC01895 | https://chamfr.com/sellers/teleflex-medical-oem-llc/ |
| Primate Chair | Custom made by University of Rochester Machine Shop | Designs online | https://marmolab.bcs.rochester.edu/resources.html |
| Poly(sodium 4-styrenesulfonate) (PSS) | Sigma Aldrich | Product # 243051 | https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/aldrich/243051 |
| RHD USB Interface board | Intan | RHD2000 Evaluation Board Version 1.0 | https://intantech.com/RHD_USB_interface_board.html |
| Silastic gel | World Precision Instruments | # KWIK-SIL | Low Toxicity Silicone Adhesive ((https://www.wpiinc.com/kwik-sil-low-toxicity-silicone-adhesive) |
| Slow release buprenorphine | Compounding Pharmacy | ||
| Stainless steel wire 36 gauge | McMaster & Carr | Cat# 6517K11 | Round Bend-and-Stay Multipurpose 304 Stainless Steel Wire, Matte Finish, 1-Foot Long, 0.008" Diameter |
| Stanley 6-Piece Precision Screwdriver Set | Stanley | 1.4mm flathead screwdriver | https://www.amazon.com/Stanley-Tools-6-Piece-Precision-Screwdriver/dp/B076621ZGC/ref=sr_1_3?crid=237VSK5FNFP9N&keywords= stanley+66-052&qid=1672764369&sprefix= stanley+66-052%2Caps%2C90&sr=8-3 |
| Steel Screws | McMaster & Carr | type 00 stainless steel hex screws and 1/8” in length | https://www.mcmaster.com/ |
| Steel Tube | McMaster & Carr | 28 gauge stainless steel tubing | https://www.mcmaster.com/tubing/multipurpose-304-stainless-steel-6/id~0-055/ |
| Superglue | Loctite | SuperGlue Gel Control | https://www.loctiteproducts.com/en/products/fix/super-glue/loctite_super_gluegelcontrol.html |
References
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