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Bioengineering

स्फेरोइड-मैट्रिक्स इंटरैक्शन का अध्ययन करने के लिए पॉलीथीन ग्लाइकोल हाइड्रोगेल में ट्यूमर स्फेरॉइड फैब्रिकेशन और एनकैप्सुलेशन

Published: September 22, 2023 doi: 10.3791/65515
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Biomedical Engineering Department, Saint Louis University

Summary

यहां, हम एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं जो हाइड्रोजेल एनकैप्सुलेशन के बाद ट्यूमर स्फेरॉइड के तेज, मजबूत और सस्ते निर्माण को सक्षम बनाता है। यह व्यापक रूप से लागू है क्योंकि इसमें विशेष उपकरणों की आवश्यकता नहीं होती है। यह गोलाकार मैट्रिक्स बातचीत की खोज और इन विट्रो ऊतक शरीर क्रिया विज्ञान या पैथोलॉजी मॉडल में निर्माण के लिए विशेष रूप से उपयोगी होगा.

Abstract

इष्टतम सेल विकास के लिए ट्यूमर माइक्रोएन्वायरमेंट को पर्याप्त रूप से दोहराने के लिए स्फेरॉइड के त्रि-आयामी (3 डी) एनकैप्सुलेशन महत्वपूर्ण है। यहां, हमने ट्यूमर बाह्य माइक्रोएन्वायरमेंट की नकल करने के लिए स्फेरॉइड एनकैप्सुलेशन के लिए इन विट्रो 3 डी ग्लियोब्लास्टोमा मॉडल तैयार किया है। सबसे पहले, हमने पॉलीडिमिथाइलसिलोक्सेन का उपयोग करके स्क्वायर पिरामिड माइक्रोवेल मोल्ड्स का गठन किया। इन माइक्रोवेल मोल्ड्स का उपयोग तब 50-500 माइक्रोन से कसकर नियंत्रित आकार के साथ ट्यूमर स्फेरॉइड बनाने के लिए किया गया था। एक बार स्फेरॉइड बनने के बाद, उन्हें पॉलीथीन ग्लाइकॉल (पीईजी) आधारित हाइड्रोगेल में काटा और समझाया गया। खूंटी हाइड्रोगेल गोलाकार एनकैप्सुलेशन के लिए एक बहुमुखी मंच है, क्योंकि हाइड्रोजेल गुणों जैसे कठोरता, गिरावट और सेल चिपकने को स्वतंत्र रूप से ट्यून किया जा सकता है। यहां, हमने ग्लियोब्लास्टोमा स्फेरॉइड को समाहित करने के लिए एक प्रतिनिधि नरम (~ 8 केपीए) हाइड्रोजेल का उपयोग किया। अंत में, दाग और छवि spheroids के लिए एक विधि confocal माइक्रोस्कोपी के माध्यम से उच्च गुणवत्ता वाले छवियों को प्राप्त करने के लिए विकसित किया गया था. घने स्फेरॉइड कोर और अपेक्षाकृत विरल परिधि के कारण, इमेजिंग मुश्किल हो सकती है, लेकिन एक समाशोधन समाधान और कॉन्फोकल ऑप्टिकल सेक्शनिंग का उपयोग इन इमेजिंग कठिनाइयों को कम करने में मदद करता है। सारांश में, हम एक समान गोलाकार बनाने के लिए एक विधि दिखाते हैं, उन्हें खूंटी हाइड्रोगेल में समाहित करते हैं और गोलाकार विकास और विभिन्न सेल-मैट्रिक्स इंटरैक्शन का अध्ययन करने के लिए इनकैप्सुलेटेड स्फेरॉइड पर कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी करते हैं।

Introduction

ट्यूमर spheroids कैंसर एटियलजि का अध्ययन करने में इन विट्रो उपकरण में उपयोगी के रूप में उभरा है, विकृति, और दवाजवाबदेही 1. परंपरागत रूप से, spheroids इस तरह के कम आसंजन प्लेटों या bioreactors के रूप में स्थितियों में सुसंस्कृत किया गया है, जहां सेल सेल आसंजन सेल सतहआसंजन 2 पर इष्ट है. हालांकि, अब यह मान्यता प्राप्त है कि ट्यूमर माइक्रोएन्वायरमेंट को अधिक ईमानदारी से पुन: व्यवस्थित करने के लिए, इन विट्रो स्फेरॉइड मॉडल में सेल-सेल और सेल-मैट्रिक्स इंटरैक्शन दोनों को पकड़ना चाहिए। इसने कई समूहों को मचानों को डिजाइन करने के लिए प्रेरित किया है, जैसे कि हाइड्रोगेल, जहां स्फेरॉइडको 3,4 समझाया जा सकता है। इस तरह के हाइड्रोजेल आधारित अंडाकार मॉडल इस तरह के व्यवहार्यता, प्रसार, स्टेमनेस, या चिकित्सा जवाबदेही 3 के रूप में विभिन्न सेल व्यवहार, पर सेल सेल और सेल मैट्रिक्स बातचीत की व्याख्या सक्षम करतेहैं.

यहां, हम पॉलीथीन ग्लाइकॉल (पीईजी) हाइड्रोगेल में ग्लियोब्लास्टोमा स्फेरॉइड के एनकैप्सुलेशन के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं। हाइड्रोगेल में ग्लियोब्लास्टोमा सेल स्फेरॉइड एनकैप्सुलेशन की कई साहित्य रिपोर्टें हैं। उदाहरण के लिए, आरजीडीएस चिपकने वाला लिगैंड के साथ सजाए गए पीईजी हाइड्रोगेल में यू 87 कोशिकाओं को एनकैप्सुलेट करके स्फेरॉइड का गठन किया गया था और सेल व्यवहार5 पर हाइड्रोजेल कठोरता के प्रभाव को निर्धारित करने के लिए एंजाइमेटिक रूप से क्लीवेबल पेप्टाइड के साथ क्रॉसलिंक किया गया था। U87 कोशिकाओं को कैंसर स्टेम सेल आबादी6 का विस्तार करने या कीमोथेरेपी प्रतिरोध 7,8,9 के मैट्रिक्स-मध्यस्थता तंत्र का पता लगाने के लिए अन्य खूंटी-आधारित या हाइलूरोनिक एसिड-आधारित हाइड्रोगेल में भी बनाया गया है। माइक्रोग्लिया और कैंसर कोशिकाओं के बीच क्रॉसस्टॉक और सेल आक्रमण10 पर इसके प्रभाव का अध्ययन करने के लिए जिलेटिन हाइड्रोगेल में ग्लियोब्लास्टोमा स्फेरॉइड्स को भी समझाया गया है। कुल मिलाकर, इस तरह के अध्ययनों ने ग्लियोब्लास्टोमा पैथोलॉजी को समझने और उपचार तैयार करने में इन विट्रो मॉडल में हाइड्रोजेल-आधारित उपयोगिता का प्रदर्शन किया है।

इसके अलावा, ट्यूमर गोलाकार निर्माण और हाइड्रोजेल एनकैप्सुलेशन11 के लिए विभिन्न तरीके हैं। उदाहरण के लिए, छितरी हुई कोशिकाओं को हाइड्रोगेल में वरीयता दी जा सकती है औरसमय 5,12 पर स्फेरॉइड बनाने की अनुमति दी जा सकती है। इस तरह की विधि का एक दोष गठित स्फेरॉइड की पॉलीडिस्पर्सिटी है, जिससे अंतर सेल प्रतिक्रियाएं हो सकती हैं। एक समान स्फेरॉइड का उत्पादन करने के लिए, कोशिकाओं microgels में encapsulated और विस्तारित अवधि के लिए सुसंस्कृत जब तक वे आक्रमण और जेल13 remodel, या कोशिकाओं गोलाकार 'छेद' के साथ टेम्पलेटेड जैल में जमा किया जा सकता है और14 कुल करने की अनुमति दी जा सकता है. इन विधियों का दोष उनकी सापेक्ष जटिलता है, माइक्रोगेल बनाने के लिए एक छोटी बूंद जनरेटर या अन्य साधनों की आवश्यकता या जेल में 'छेद' और स्फेरॉइड को बढ़ने और परिपक्व होने में लगने वाला समय। वैकल्पिक रूप से, spheroids microwells 9,15,16 में या फांसी ड्रॉप प्लेटों17,18 में पूर्व गठन किया जा सकता है और फिर एक हाइड्रोजेल में encapsulated, यहाँ वर्णित तकनीक के समान. ये विधियां सरल हैं और उच्च थ्रूपुट फैशन में की जा सकती हैं। दिलचस्प है, यह दिखाया गया है कि गोलाकार गठन की विधि जीन अभिव्यक्ति, सेल प्रसार, या दवाजवाबदेही 19,20 के रूप में अंडाकार आकृति कोशिका व्यवहार, को प्रभावित कर सकते हैं.

यहां, हम ग्लियोब्लास्टोमा पर ध्यान केंद्रित करते हैं क्योंकि यह एक ठोस ट्यूमर है जिसका मूल वातावरण नरम, नैनोपोरस मस्तिष्क मैट्रिक्स21 है, जिसे नरम, नैनोपोरस हाइड्रोजेल द्वारा नकल किया जा सकता है। ग्लियोब्लास्टोमा भी सबसे घातक मस्तिष्क कैंसर है जिसके लिए कोई उपलब्ध इलाज नहीं है22. हालांकि, यहां वर्णित प्रोटोकॉल का उपयोग किसी भी ठोस ट्यूमर का प्रतिनिधित्व करने वाले स्फेरॉइड के एनकैप्सुलेशन के लिए किया जा सकता है। हम खूंटी हाइड्रोगेल है कि एक माइकल प्रकार के अतिरिक्त प्रतिक्रिया23 के माध्यम से गठित कर रहे हैं का उपयोग करने के लिए चुना. खूंटी एक सिंथेटिक, गैर सड़नशील, और निष्क्रिय है कि जैव संगत हाइड्रोजेल है और मचान और भौतिक सेल समर्थन के रूप में कार्य करता है लेकिन सेल लगाव23 का समर्थन नहीं करता है. सेल चिपकने वाला पूरे प्रोटीन या चिपकने वाला ligands24 के tethering के माध्यम से अलग से जोड़ा जा सकता है, और गिरावट खूंटी बहुलक श्रृंखला या hydrolytically या enzymatically सड़नशील crosslinkers 25,26 के रासायनिक संशोधनों के माध्यम से जोड़ा जा सकता है. यह जैव रासायनिक गुणों को यांत्रिक या भौतिक हाइड्रोगेल गुणों से स्वतंत्र रूप से ट्यून करने की अनुमति देता है, जो सेल-मैट्रिक्स इंटरैक्शन का अध्ययन करने में फायदेमंद हो सकता है। माइकल-प्रकार का जेलेशन रसायन चयनात्मक है और शारीरिक स्थितियों में होता है; इसलिए, यह केवल हाइड्रोजेल अग्रदूत समाधान के साथ स्फेरॉइड मिश्रण करके गोलाकार एनकैप्सुलेशन की अनुमति देता है।

कुल मिलाकर, यहां प्रस्तुत कार्यप्रणाली में कई उल्लेखनीय विशेषताएं हैं। सबसे पहले, एक मल्टीवेल असेंबली में ट्यूमर स्फेरॉइड का निर्माण कुशल, त्वरित है, और आवश्यक सामग्री की लागत कम है। दूसरा, स्फेरॉइड कम पॉलीडिस्पर्सिटी के साथ विभिन्न आकारों में बड़े बैचों में उत्पादित होते हैं। अंत में, केवल व्यावसायिक रूप से उपलब्ध सामग्री की आवश्यकता होती है। कार्यप्रणाली की उपयोगिता को गोलाकार कोशिका व्यवहार्यता, परिपत्रता और कोशिका उपजी पर सब्सट्रेट गुणों के प्रभाव की खोज करके चित्रित किया गया है।

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Protocol

1. समाधान तैयार करना

  1. पॉलीडिमिथाइलसिलोक्सेन (पीडीएमएस) अग्रदूत समाधान की तैयारी
    1. नकारात्मक पीडीएमएस अग्रदूत समाधान तैयार करें (गोंद अग्रदूत समाधान के लिए भी उपयोग किया जाता है)। इलास्टोमेर को एक स्पैटुला का उपयोग करके एक तौलने वाली नाव में स्कूप करें और उसका वजन करें। इलास्टोमेर बेस में 1:10 के अनुपात में इलाज एजेंट जोड़ें। प्लास्टिक वजन नाव में स्पैटुला का उपयोग करके पीडीएमएस और इलाज एजेंट को धीरे और अच्छी तरह से मिलाएं।
      नोट: यह पीडीएमएस अग्रदूत समाधान नकारात्मक मोल्ड बनाने के लिए 6-अच्छी तरह से वर्ग पिरामिड माइक्रोवेल प्लेट में डाला जाता है। यह वही समाधान है जिसका उपयोग गोंद अग्रदूत समाधान के लिए किया जाता है।
    2. सकारात्मक PDMS अग्रदूत समाधान तैयार करें। इलास्टोमेर बेस को एक स्पैटुला का उपयोग करके वेट बोट में स्कूप करें और उसका वजन करें। इलास्टोमेर बेस में 1:9 के अनुपात में इलाज एजेंट डालें। प्लास्टिक वजन नाव में स्पैटुला का उपयोग करके पीडीएमएस और इलाज एजेंट को धीरे और अच्छी तरह से मिलाएं।
      नोट: यह पीडीएमएस अग्रदूत समाधान बाद में सकारात्मक मोल्ड बनाने के लिए नकारात्मक मोल्ड पर डाला जाता है।
  2. पीएच 8 के 0.3 एम ट्राइथेनॉलमाइन (टीईए) बफर की तैयारी
    1. पिपेट टीईए के 1 एमएल और 1x फॉस्फेट-बफर खारा (पीबीएस) के 9 एमएल को 0.75 एम टीईए समाधान बनाने के लिए एक विंदुक सहायता का उपयोग करके 50 एमएल शंक्वाकार में। 1 एन एचसीएल या 1 एन एनएओएच का उपयोग करके 8 के पीएच के समाधान को अनुमापित करें। फिर, 8 के पीएच के साथ 0.3 एम की अंतिम टीईए एकाग्रता प्राप्त करने के लिए 25 एमएल की अंतिम मात्रा प्राप्त करने के लिए पर्याप्त 1x पीबीएस जोड़ें।
      चेतावनी: कमरे के तापमान (आरटी) पर एक ज्वलनशील कैबिनेट में एचसीएल और NaOH समाधान स्टोर करें। हाताळताना वैयक्तिक सुरक्षा उपकरणे घाला.
  3. संपूर्ण मीडिया की तैयारी
    1. पूरा मीडिया तैयार करने के लिए, भ्रूण गोजातीय सीरम के 10% (डब्ल्यू / वी) या 56 एमएल और 500 एमएल आरपीएमआई माध्यम में 1% (डब्ल्यू / वी) या 5.6 एमएल पेनिसिलिन और स्ट्रेप्टोमाइसिन जोड़ें।
    2. समाधान को 37 डिग्री सेल्सियस पर 10-20 मिनट के लिए या जब तक समाधान उपयोग करने से पहले गर्म न हो जाए।
    3. समाधान को 0-4 डिग्री सेल्सियस पर 6 महीने तक स्टोर करें।
  4. 20% (w/v) पॉलीथीन ग्लाइकॉल (PEG) स्टॉक समाधान तैयार करना
    नोट: गणना 100 माइक्रोन समाधानों पर आधारित है जिन्हें आवश्यकतानुसार ऊपर या नीचे बढ़ाया जा सकता है।
    1. 20% w/v 4-आर्म PEG-Acrylate (4-आर्म PEG-Ac) का 100 μL स्टॉक समाधान तैयार करने के लिए, माइक्रोफ्यूज ट्यूब में 20 मिलीग्राम 4-आर्म PEG-AC पाउडर का वजन करें। 0.3 एम टीईए बफर के 70 माइक्रोन जोड़ें, फिर लगभग 30 एस के लिए या पूरी तरह से भंग होने तक समाधान भंवर करें। 100 माइक्रोन के अंतिम समाधान मात्रा तक पहुंचने के लिए पर्याप्त टीईए बफर (~ 27 माइक्रोन) जोड़कर पाउडर विघटन के कारण मात्रा परिवर्तन के लिए खाता।
    2. 20% w/v PEG-diSH का 100 μL स्टॉक घोल तैयार करने के लिए, एक माइक्रोफ्यूज ट्यूब में 20 मिलीग्राम PEG-diSH पाउडर का वजन करें। टीईए बफर के 70 माइक्रोन जोड़ें, फिर लगभग 30 एस के लिए या पूरी तरह से भंग होने तक समाधान भंवर करें। 100 माइक्रोन के अंतिम समाधान मात्रा तक पहुंचने के लिए पर्याप्त टीईए बफर (~ 27 माइक्रोन) जोड़कर पाउडर विघटन के कारण मात्रा परिवर्तन के लिए खाता।
      नोट: खूंटी पाउडर बहुत हीड्रोस्कोपिक है और इसे -20 डिग्री सेल्सियस पर एक सूखे कंटेनर में संग्रहीत करने की आवश्यकता है। इसे फ्रीजर से बाहर निकालते समय, पाउडर को तौलने के लिए बोतल खोलने से पहले खूंटी पाउडर को 10 मिनट के लिए पिघलने दें। फ्रीजर में लौटने से पहले नम हवा को विस्थापित करने के लिए नाइट्रोजन या आर्गन जैसी अक्रिय गैस के साथ बोतल को शुद्ध करें। 4-आर्म पीईजी-एसी का स्टॉक समाधान उपयोग करने से पहले 2 सप्ताह तक 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है। पीईजी-डीआईएसएच के स्टॉक समाधान को उपयोग से तुरंत पहले तैयार करने की आवश्यकता होती है और इसे संग्रहीत नहीं किया जा सकता है क्योंकि थिओल समूह डाइसल्फ़ाइड बॉन्ड बनाने के लिए एक दूसरे के साथ प्रतिक्रिया करते हैं।
  5. 2% वी/वी बेसमेंट झिल्ली मैट्रिक्स समाधान की तैयारी
    1. एक 2% वी / वी तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स काम कर समाधान तैयार करने के लिए, पूरा मीडिया के 9.98 एमएल तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स (एलडीईवी मुक्त) के 20 माइक्रोन जोड़ें और ~ 10 बार ऊपर और नीचे पाइपिंग द्वारा अच्छी तरह से मिश्रण. 4 डिग्री सेल्सियस (बर्फ पर) पर समाधान तैयार करें, फिर इसे 37 डिग्री सेल्सियस (ओवन या इनक्यूबेटर में) तक गर्म करें और तुरंत उपयोग करें।
      नोट: तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स >10 डिग्री सेल्सियस पर एक जेल बनाना शुरू कर देगा, इसलिए 2-6 डिग्री सेल्सियस पर पूर्ण मीडिया के साथ तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स समाधान मिश्रण करना सुनिश्चित करें। पूरा मीडिया रचना चरण 1.3 में वर्णित है.
  6. सेल लगानेवाला समाधान की तैयारी
    1. पैराफॉर्मेल्डिहाइड के 4% w/v और नॉनऑनिक सर्फेक्टेंट के 0.1% v/v वाले सेल फिक्सेटिव समाधान के 1 एमएल तैयार करने के लिए, पहले 1x पीबीएस के 891 माइक्रोन और पैराफॉर्मेल्डिहाइड के 108 माइक्रोन (37% w/v एकाग्रता) मिलाएं, और फिर नॉनऑनिक सर्फेक्टेंट (100% एकाग्रता) के 1 माइक्रोन जोड़ें। घोल को अच्छी तरह मिला लें।
      नोट: फिक्सेटिव समाधान हर बार निर्धारण किया जाता है ताजा बनाया जाना चाहिए।
      चेतावनी: पैराफॉर्मलडिहाइड ज्वलनशील है और हवा में दहनशील धूल सांद्रता बना सकता है। यह त्वचा में जलन और आंखों की गंभीर क्षति का कारण बनता है। सांस लेने से बचें क्योंकि इससे श्वसन जलन हो सकती है। एक रासायनिक धूआं हुड में पैराफॉर्मलडिहाइड को संभालें और व्यक्तिगत सुरक्षा उपकरण पहनें। संभालने के बाद हाथों को अच्छी तरह धोएं। नॉनऑनिक सर्फेक्टेंट त्वचा में जलन और आंखों की गंभीर क्षति का कारण बनता है। संभालते समय सुरक्षात्मक दस्ताने और आंखों की सुरक्षा या चेहरे की सुरक्षा पहनें। पर्यावरण में रिलीज से बचने के लिए, एक रासायनिक धूआं हुड में बोतल खोलें। संभालने के बाद हाथों को अच्छी तरह धोएं।
  7. धुंधला समाधान की तैयारी
    1. 3,3'-डायहेक्सिलोक्साकार्बोसायनिन आयोडाइड (डीआईओसी) के 3 एमएम तैयार करने के लिए, डीएमएसओ के 1 एमएल में 2.65 मिलीग्राम डीआईओसी मिलाएं।
    2. प्रोपिडियम आयोडाइड समाधान (पीआई) के 1.5 एमएम तैयार करने के लिए, डी-आयनीकृत पानी के 1 एमएल में 1 मिलीग्राम पीआई मिलाएं।
  8. गोलाकार समाशोधन समाधान की तैयारी
    1. गोलाकार समाशोधन के लिए 1x पीबीएस में फॉर्मामाइड के 20%, 40%, और 80% v/v के समाशोधन समाधान तैयार करें।
      1. 20% वी/वी फॉर्ममाइड के 10 एमएल बनाने के लिए, फॉर्मामाइड के 2 एमएल के बाद 1x पीबीएस के 8 एमएल मिलाएं। 40% वी/वी फॉर्मामाइड के 10 एमएल बनाने के लिए, फॉर्मामाइड के 4 एमएल के बाद 1x पीबीएस के 6 एमएल मिलाएं। 80% वी/वी फॉर्मामाइड के 10 एमएल बनाने के लिए, फॉर्मामाइड के 8 एमएल के बाद 1x पीबीएस के 2 एमएल मिलाएं।
      2. फॉर्मामाइड और 1x पीबीएस के संयोजन के बाद, लगभग 30 एस के लिए भंवर द्वारा समाधान मिलाएं।

2. वर्ग पिरामिड माइक्रोवेल्स का निर्माण

  1. चित्र 1 में दिखाए गए अनुसार वर्ग पिरामिड माइक्रोवेल्स के नकारात्मक पीडीएमएस मोल्ड का निर्माण करें।
    1. नकारात्मक पीडीएमएस अग्रदूत समाधान के 2 ग्राम (~ 1 एमएल) तैयार करें और इसे 6-अच्छी तरह से वर्ग पिरामिड मास्टर मोल्ड के एक कुएं पर डालें। ध्यान दें कि 1 एमएल पूरी तरह से थाली के एक अच्छी तरह से शामिल किया गया. पीडीएमएस के साथ मास्टर मोल्ड को कवर करने के बाद, एक वैक्यूम desiccator में 6 अच्छी तरह से वर्ग पिरामिड प्लेट रखकर 30 मिनट के लिए PDMS अग्रदूत समाधान degas. फिर, 24 घंटे के लिए एक 60 डिग्री सेल्सियस ओवन में थाली रखकर PDMS का इलाज.
      नोट: सुनिश्चित करें कि प्लेट ढक्कन degassing के लिए हटा दिया जाता है और इलाज के लिए वापस रखा जाता है. एक वैक्यूम desiccator में या नाइट्रोजन या आर्गन जैसे निष्क्रिय गैस के साथ शुद्ध करने के माध्यम से समाधान को डीगास करें। यदि नकारात्मक मोल्ड अग्रदूत समाधान में अभी भी 30 मिनट के बाद बुलबुले हैं, तो अपर्याप्त गिरावट का संकेत देते हुए, इसे अतिरिक्त 30 मिनट के लिए वैक्यूम डेसीकेटर में रखें। एक या एक से अधिक पीडीएमएस नकारात्मक सांचों को तैयार करने के लिए एक साथ एक या कई प्लेट कुओं का उपयोग करें। विभिन्न आकारों के स्क्वायर पिरामिड माइक्रोवेल्स का उपयोग किया जा सकता है, जैसे कि 400 और 800 माइक्रोन पक्ष की लंबाई, जैसा कि तालिका 1में दिखाया गया है। वर्ग पिरामिड आकारों की परवाह किए बिना पीडीएमएस की समान मात्रा का उपयोग किया जाता है।
    2. एक बार पीडीएमएस अभी भी गर्म होने पर ठीक हो जाता है, ध्यान से एक स्पैटुला का उपयोग करके मास्टर मोल्ड से नकारात्मक पीडीएमएस मोल्ड को हटा दें और बायोप्सी पंच का उपयोग करके 35 मिमी व्यास स्लैब में नकारात्मक मोल्ड काट लें। एक पेट्री डिश में रखें और ढक्कन के साथ कवर करें और अतिरिक्त 24 घंटे के लिए आरटी को जारी रखने की अनुमति दें।
      नोट: नकारात्मक सांचों को हटाने के लिए, अच्छी तरह से प्लेट और पीडीएमएस मोल्ड के बीच जाने के लिए एक स्पैटुला का उपयोग करें और मास्टर मोल्ड से नकारात्मक मोल्ड को धीरे से खींचें। मोल्ड को 35 मिमी पेट्री डिश फिट करने के लिए 35 मिमी स्लैब में काट दिया जाता है। विभिन्न व्यास की प्लेटों को फिट करने के लिए नए नए साँचे अन्य आकारों में बनाए जा सकते हैं। 35 मिमी नकारात्मक मोल्ड स्लैब को संग्रहीत किया जा सकता है, आरटी पर धूल से संरक्षित किया जा सकता है, और 6 महीने के लिए पुन: उपयोग किया जा सकता है।
  2. वर्ग पिरामिड microwells के सकारात्मक PDMS ढालना तैयार करें.
    1. नकारात्मक PDMS ढालना के 35 मिमी स्लैब एक 35 मिमी पेट्री डिश बनावट microwells का सामना करना पड़ के साथ प्लेस.
    2. ऊपर के रूप में सकारात्मक पीडीएमएस अग्रदूत समाधान के 2.5 ग्राम (~ 1.2 एमएल) तैयार करें और इसे नकारात्मक मोल्ड को पूरी तरह से कवर करने के लिए 35 मिमी पेट्री डिश में नकारात्मक मोल्ड पर डालें। फिर ऊपर के रूप में 30 मिनट के लिए अग्रदूत समाधान degas और 3-4 घंटे के लिए 60 डिग्री सेल्सियस ओवन में जगह.
      नोट: क्योंकि पीडीएमएस चिपचिपा है, नकारात्मक मोल्ड के नीचे फंसी हवा से एक बुलबुला बन सकता है। यदि नकारात्मक मोल्ड के नीचे एक बुलबुला बनता है, तो बुलबुले को छोड़ने के लिए एक स्पैटुला का उपयोग करके मोल्ड को धीरे से नीचे धकेलें। यदि हवा के बुलबुले रहते हैं, तो 30 मिनट के लिए degassing जारी रखें, या एक रंग लें और बुलबुले पॉप तक सकारात्मक मोल्ड समाधान को धीरे से हिलाएं।
    3. एक बार सकारात्मक पीडीएमएस मोल्ड ठीक हो जाने के बाद, 35 मिमी पेट्री डिश से नए नए साँचे हटा दें और तुरंत नकारात्मक मोल्ड से सकारात्मक मोल्ड को छील दें।
      नोट: सकारात्मक मोल्ड के सफल छीलने के लिए समय महत्वपूर्ण है। सकारात्मक और नकारात्मक मोल्ड के बीच इंटरफेस को उजागर करने और एक दूसरे से नए नए साँचे को छीलने के लिए एक रेजर का उपयोग करके सकारात्मक मोल्ड में थोड़ा काटकर निष्कासन सबसे अच्छा किया जाता है। फिर गोलाकार मोल्ड के किनारों को छील लें। सकारात्मक मोल्ड से नकारात्मक मोल्ड को धीरे से छीलें।
  3. 48-अच्छी प्लेट के कुओं के नीचे नए नए साँचे को गोंद करें।
    नोट: यहां, एक 48-अच्छी तरह से प्लेट का उपयोग किया जाता है, लेकिन अन्य प्लेटों का उपयोग तब तक किया जा सकता है जब तक मोल्ड स्लैब सही व्यास में काटे जाते हैं (उदाहरण के लिए, 96-अच्छी प्लेट के लिए व्यास में 6 मिमी)।
    1. एक 10 मिमी बायोप्सी पंच का उपयोग स्लैब में सकारात्मक नए नए साँचे काटें.
      नोट: लगभग 4 मोल्ड (प्रत्येक 10 मिमी व्यास) को एक 35 मिमी व्यास सकारात्मक मोल्ड से काटा जा सकता है।
    2. एक 48 अच्छी तरह से थाली के तल करने के लिए नए नए साँचे गोंद तैयार पीडीएमएस गोंद अग्रदूत समाधान (~ 0.5 एमएल या 1 ग्राम) के रूप में पहले27 वर्णित है. पीडीएमएस अग्रदूत समाधान में 10 मिमी सकारात्मक मोल्ड के फ्लैट पक्ष (माइक्रोवेल्स के पैटर्न के साथ पक्ष नहीं) को धीरे से डुबोने के लिए चिमटी का उपयोग करें। ध्यान से एक 48 अच्छी तरह से थाली के अच्छी तरह से प्रति एक ढालना जगह है, और धीरे चिमटी का उपयोग कर अच्छी तरह से नीचे करने के लिए प्रत्येक मोल्ड दबाएँ. पीडीएमएस गोंद को ठीक करने की अनुमति देने के लिए 4-24 घंटे के लिए 60 डिग्री सेल्सियस ओवन में इकट्ठे प्लेट रखें।
      नोट: यदि पीडीएमएस गोंद अग्रदूत समाधान सकारात्मक मोल्ड माइक्रोवेल्स पर मिलता है, तो इसे नरम टिशू पेपर का उपयोग करके मिटा दिया जा सकता है, और चरण दोहराया जा सकता है। ग्लूइंग करते समय, सुनिश्चित करें कि गोंद माइक्रोवेल्स को कवर नहीं करता है।
    3. 1000 माइक्रोन विंदुक का उपयोग करके 48-अच्छी प्लेट के प्रत्येक कुएं में 70% इथेनॉल के 300 माइक्रोन जोड़कर नए नए साँचे को स्टरलाइज़ करें। 70% इथेनॉल को महाप्राण करें और 2 घंटे के लिए यूवी (302 एनएम) के तहत टिशू कल्चर हुड में खुला 48-अच्छी प्लेट रखें।
      नोट: नए नए साँचे का उपयोग 6 महीने तक किया जा सकता है और आवश्यकतानुसार फिर से निष्फल किया जा सकता है।

3. हाइड्रोगेल में बहुकोशिकीय ट्यूमर स्फेरॉइड गठन, फसल और एनकैप्सुलेशन

नोट: इस खंड में उल्लिखित प्रोटोकॉल यू 87 मानव ग्लियोब्लास्टोमा सेल लाइन ( चित्रा 1 और चित्रा 2 देखें) के लिए है, लेकिन एक समान प्रोटोकॉल का उपयोग अन्य कैंसर सेल प्रकारों के साथ किया जा सकता है।

  1. बहुकोशिकीय ट्यूमर स्फेरॉइड गठन
    1. 1000 माइक्रोन विंदुक का उपयोग करके प्रत्येक अच्छी तरह से समाधान के 300 माइक्रोन जोड़कर एक विरोधी पालन रिंसिंग समाधान के साथ पहले माइक्रोवेल मोल्ड्स धोएं। फिर, 3 मिन के लिए 1620 x ग्राम पर अपकेंद्रित्र और वैक्यूम पंप और पाश्चर विंदुक का उपयोग करके समाधान को महाप्राण करें।
      नोट: सेल सीडिंग से तुरंत पहले इस चरण को करें।
    2. कोशिकाओं को 37 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिन के लिए कल्चर फ्लास्क क्षेत्र केप्रत्येक सेमी 2 प्रति 0.25% ट्रिप्सिन/ईडीटीए के ~ 80 माइक्रोन में बेनकाब करें। उदाहरण के लिए, ट्रिप्सिन/ईडीटीए का 1 एमएल टी -25 सेल कल्चर फ्लास्क के लिए उपयुक्त है। पूर्ण सेल संस्कृति माध्यम की समान मात्रा जोड़कर ट्रिप्सिन को बेअसर करें। उदाहरण के लिए, ट्रिप्सिन युक्त टी -25 सेल संस्कृति फ्लास्क में पूर्ण माध्यम के 1 एमएल जोड़ें। टिशू कल्चर फ्लास्क से कोशिकाओं को इकट्ठा करें।
    3. सेल गिनती के लिए एक हेमोसाइटोमीटर के प्रत्येक बंदरगाह में सेल निलंबन के 10 माइक्रोन स्थानांतरण। कोशिकाओं की कुल संख्या और कम से कम 8 चतुर्थांशों से उस सेल गिनती को औसत करने के लिए एक उल्टे माइक्रोस्कोप का उपयोग करें, यह सुनिश्चित करते हुए कि प्रत्येक हेमोसाइटोमीटर चतुर्थांश में सेल नंबर अच्छे सेल गणना परिणामों के लिए 20-50 है। अंतिम सेल एकाग्रता निर्धारित करने के लिए गणना की संख्या को 104 से गुणा करें।
    4. वांछित स्फेरॉइड आकार के आधार पर, वांछित स्फेरॉइड आकार के आधार पर, वांछित स्फेरॉइड आकार के आधार पर, पूर्ण आरपीएमआई सेल संस्कृति माध्यम में एकत्रित कोशिकाओं को फिर से निलंबित करें, जैसा कि तालिका 1में दिखाया गया है।
      नोट: 800 माइक्रोन माइक्रोवेल्स 48-अच्छी प्लेट के एक कुएं में ~ 75 स्फेरॉइड पैदा करेंगे, और 400 माइक्रोन माइक्रोवेल्स 48-अच्छी प्लेट के एक कुएं में ~ 300 स्फेरॉइड पैदा करेंगे।
    5. माइक्रोवेल्स में वांछित एकाग्रता पर सेल निलंबन के 500 माइक्रोन रखें और प्लेट को 3 मिन के लिए 1620 x ग्राम पर अपकेंद्रित्र करें। थाली को 37 डिग्री सेल्सियस पर आर्द्र इनक्यूबेटर में रखें और 24 घंटे के लिए 5% सीओ2 ताकि स्फेरॉइड बन सकें।
      नोट: यदि स्फेरॉइड नहीं बनते हैं, तो पूर्ण मीडिया के साथ संयुक्त तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स के 2% वी / वी का उपयोग कोशिकाओं को फिर से निलंबित करने के लिए किया जा सकता है (चरण 1.5 में अधिक विवरण)।
  2. स्फेरॉइड की कटाई
    1. 1000 माइक्रोन विंदुक का उपयोग करके, अच्छी तरह से पूर्ण माध्यम के मजबूती से पिपेट 500 माइक्रोन। अच्छी तरह से मध्यम के 500 माइक्रोन का प्रयोग, अच्छी तरह से (विशेष रूप से ऊपर, नीचे, छोड़ दिया और सही quadrants) के चार quadrants ऊपर और नीचे quadrants तीन से चार बार पाइपिंग द्वारा फ्लश स्फेरोइड नापसंद करने के लिए. धीरे एक 1000 माइक्रोन विंदुक का उपयोग कर एक microcentrifuge ट्यूब में spheroids (~ 1000 μL कुल) युक्त माध्यम महाप्राण और नीचे करने के लिए बसने के लिए spheroids की अनुमति देते हैं.
    2. सतह पर तैरनेवाला निकालें और वांछित अंतिम एकाग्रता के लिए spheroids resuspend. उदाहरण के लिए, एनकैप्सुलेशन के बाद 20 माइक्रोन जेल में ~ 8 स्फेरॉइड प्राप्त करने के लिए, स्फेरॉइड निलंबन में ~ 75 स्फेरोइड्स / 100 माइक्रोन की एक गोलाकार एकाग्रता उपज, मीडिया के 100 माइक्रोन में स्फेरॉइड को फिर से निलंबित करें।
  3. हाइड्रोगेल में स्फेरॉइड एनकैप्सुलेशन, जैसा कि चित्र 2 में दिखाया गया है।
    1. 10% w/v PEG हाइड्रोगेल अग्रदूत समाधान के 100 μL बनाने के लिए, स्फेरॉइड सस्पेंशन के 50 μL को मिलाएं, इसके बाद 20% w/v 4-आर्म PEG-AC के 30 μL और अंत में 20% w/v PEG-diSH के 20 μL को एक माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब में मिलाएं। यह इष्टतम क्रॉसलिंकिंग सुनिश्चित करने वाले थियोल (एसएच) समूहों को एक्रिलेट (एसी) का स्टोचियोमेट्रिक मोलर अनुपात देगा। ~ 10 बार ऊपर और नीचे पाइपिंग करके जेल अग्रदूत समाधान मिलाएं।
      नोट: हाइड्रोजेल संरचना, मात्रा, और बहुलक संगीत कार्यक्रम को आवश्यकतानुसार बदला जा सकता है। परिणामी हाइड्रोगेल धीरे-धीरे अपमानजनक और गैर-सेल चिपकने वाला होगा। हाइड्रोजेल सेल चिपकने वाला बनाने के लिए, आरजीडीएस जैसे चिपकने वाला लिगैंड जोड़ा जा सकता है। हाइड्रोजेल को एंजाइमेटिक रूप से डिग्रेडेबल बनाने के लिए, दोनों सिरों पर सिस्टीन अवशेषों वाला एक एंजाइमेटिक रूप से डिग्रेडेबल पेप्टाइड क्रॉसलिंकर जोड़ा जा सकता है। स्फेरॉइड को स्थानांतरित करते समय, धीरे से समाधान को दो बार पिपेट करने के लिए स्फेरॉइड को नापसंद करें और स्फेरॉइड के वितरण को सुनिश्चित करने के लिए उन्हें निलंबन में लाएं।
    2. 1 मिमी सिलिकॉन स्पेसर के साथ अलग किए गए दो पैराफिल्म-लाइन वाले ग्लास स्लाइड के बीच जेल अग्रदूत समाधान के पिपेट 20 माइक्रोन, और जेल अग्रदूत समाधान के साथ स्लाइड को 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ2 इनक्यूबेटर में 15 मिनट के लिए जेल के लिए अनुमति देने के लिए जगह दें।
      नोट: सुनिश्चित करें कि दो ग्लास स्लाइड पैराफिल्म में कवर किए गए हैं ताकि हाइड्रोफोबिक सतह बनाई जा सके जिससे जेलेशन पर आसान छीलने की अनुमति मिल सके। पैराफिल्म के बजाय, एक हाइड्रोफोबिक कोटिंग समाधान का उपयोग किया जा सकता है। हाइड्रोजेल अग्रदूत समाधान की 20 माइक्रोन मात्रा के परिणामस्वरूप सूजन से पहले ~ 6 मिमी व्यास और ऊंचाई में 1 मिमी का हाइड्रोजेल स्लैब होगा। किसी भी स्पेसर प्रकार और मोटाई का उपयोग किया जा सकता है, लेकिन यह अनुशंसा की जाती है कि जेल की मोटाई 1 मिमी या उससे कम रखी जाए (मोटा हाइड्रोगेल ऑक्सीजन प्रसार और कोशिकाओं को पोषक तत्वों के परिवहन को सीमित कर सकता है) लेकिन गोलाकार व्यास से बड़ा (ताकि स्फेरॉइड पूरी तरह से जेल में समझाया गया हो)। हाइड्रोजेल अग्रदूत समाधान की किसी भी मात्रा का उपयोग किया जा सकता है। 20-30 माइक्रोन जैल 24-अच्छी प्लेट के लिए उपयुक्त हैं।
    3. एक बार हाइड्रोजेल जेलेशन पूरा हो जाने के बाद, दो ग्लास स्लाइड्स को अलग करें और धीरे से एक स्पैटुला का उपयोग करके ग्लास प्लेट से जैल को छील लें। जैल को 24-अच्छी तरह से प्लेट में रखें, एक प्रति कुआं, यह सुनिश्चित करते हुए कि स्फेरॉइड वाले सतह का सामना करना पड़ता है।
      नोट: जेल के दौरान स्फेरॉइड जेल के नीचे गिर जाएंगे, इसलिए संवर्धन के लिए उन्हें उलटना यह सुनिश्चित करेगा कि स्फेरॉइड पोषक तत्वों और ऑक्सीजन तक बेहतर पहुंच के लिए हाइड्रोजेल की सतह के पास हैं। माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब में शेष किसी भी हाइड्रोजेल अग्रदूत समाधान को देखकर जेलेशन की निगरानी की जा सकती है और ट्यूब को उलटकर स्लैब बनाने के लिए उपयोग नहीं किया जाता है और उस समय को ध्यान में रखते हुए जब जेल बहना बंद हो जाता है।
    4. प्रत्येक अच्छी तरह से पूरा माध्यम (~ 500 माइक्रोन) जोड़ें और सुनिश्चित करें कि हाइड्रोजेल पूरी तरह से जलमग्न है। मल्टीवेल प्लेट को 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ2 पर एक आर्द्र इनक्यूबेटर में रखें और हर 2-3 दिनों में मध्यम परिवर्तन के साथ कोशिकाओं को संस्कृति दें।
      नोट: हाइड्रोगेल को 4 सप्ताह तक या हाइड्रोगेल के खराब होने तक सुसंस्कृत किया जा सकता है, हर दूसरे दिन मीडिया को बदल सकता है।

4. फ्लोरोसेंट धुंधला हो जाना

  1. सेल व्यवहार्यता
    1. दाग 3,3'-dihexyloxacarbocyanine आयोडाइड (DiOC) का उपयोग करें, जो सेल व्यवहार्यता निर्धारित करने के लिए सभी कोशिकाओं के माइटोकॉन्ड्रिया और एंडोप्लाज्मिक रेटिकुलम को दाग देता है। 0.02 माइक्रोग्राम/एमएल की एकाग्रता पर डीआईओसी (3 मिमी) का प्रयोग करें। विशेष रूप से, अलग कोशिकाओं (धारा 3 में गोलाकार के गठन की प्रक्रिया से कम से कम 24 घंटे पहले) में मीडिया के प्रत्येक 1000 माइक्रोन प्रति डीआईओसी के 2 माइक्रोन जोड़ने के लिए 20 माइक्रोन विंदुक का उपयोग करें। DiOC कोशिकाओं दाग करने के लिए 24 घंटे की अनुमति दें.
    2. परमाणु और गुणसूत्र दाग, प्रोपिडियम आयोडाइड, पीआई (1.50 मिमी) का उपयोग करें, जो केवल मृत कोशिकाओं में प्रवेश करता है। कोशिकाओं को दागने के लिए, पहले सभी मीडिया को महाप्राण करें और 1x पीबीएस के 500 माइक्रोन जोड़ने के लिए 1000 माइक्रोन विंदुक का उपयोग करके जेल को कुल्लाएं ताकि जेल पूरी तरह से जलमग्न हो जाए।
    3. पीबीएस को महाप्राण करें और ताजा मीडिया के 500 माइक्रोन जोड़ें, इसके बाद प्रत्येक अच्छी तरह से पीआई समाधान के 30 माइक्रोन (यानी, मीडिया के प्रत्येक 100 माइक्रोन प्रति 6 माइक्रोन)। अच्छी प्लेट को प्रकाश से बचाने के लिए एल्यूमीनियम पन्नी के साथ कवर करें। 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ2 पर एक इनक्यूबेटर में अच्छी तरह से प्लेट रखें और पीआई के लिए मृत कोशिकाओं को दागने के लिए 30 मिनट की अनुमति दें।
    4. पन्नी निकालें और कुओं से मीडिया महाप्राण. हाइड्रोजेल को जलमग्न करने के लिए 1x पीबीएस के 500 माइक्रोन जोड़ने के लिए 1000 माइक्रोन विंदुक का उपयोग करें। 1x पीबीएस महाप्राण और दो अतिरिक्त बार कुल्ला दोहराएँ. प्रत्येक अच्छी तरह से मीडिया के 500 माइक्रोन जोड़ें और एक फ्लोरोसेंट उलटा या फोकल माइक्रोस्कोप के तहत छवि।
    5. डीआईओसी (सभी कोशिकाओं) के क्षेत्र की तुलना पीआई (मृत कोशिकाओं) से करके सेल व्यवहार्यता की गणना करें, जैसा कि समीकरण 1 में दर्शाया गया है, एक कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप या एक उल्टे फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप से जेड-स्टैक छवियों का उपयोग करके।
      Equation 1 समीकरण 1.

5. Immunofluorescence निर्धारण, धुंधला हो जाना, समाशोधन, और encapsulated spheroids की इमेजिंग

  1. फिक्सेशन और धुंधला हो जाना
    1. कुओं से मीडिया को महाप्राण करें जहां हाइड्रोगेल सुसंस्कृत हैं, और हाइड्रोगेल पर सीधे 1x पीबीएस के 500 माइक्रोन को पाइप करके हाइड्रोगेल को कुल्ला। धीरे 1x पीबीएस महाप्राण.
    2. अच्छी तरह से प्रति लगानेवाला समाधान की 500 माइक्रोन मात्रा जोड़ने के लिए 1000 माइक्रोन विंदुक का उपयोग करके 24 अच्छी तरह से थाली में गोलाकार फिक्स करें. आरटी पर 30 मिनट के लिए जैल भिगोने के लिए लगानेवाला की अनुमति दें एक 1000 माइक्रोन विंदुक का उपयोग कर लगानेवाला समाधान निकालें और एक नामित अपशिष्ट कंटेनर में त्यागें.
    3. प्रत्येक अच्छी तरह से करने के लिए 1x पीबीएस के 500 माइक्रोन जोड़कर हाइड्रोगेल कुल्ला. एक 1000 माइक्रोन विंदुक का उपयोग कर 1x पीबीएस महाप्राण और पीबीएस दो अतिरिक्त बार कुल्ला दोहराएँ. 1 सप्ताह तक के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर अच्छी तरह से 1x पीबीएस प्रति 1x पीबीएस के 500 माइक्रोन में अच्छी तरह से प्लेट स्टोर करें या तुरंत उपयोग करें।
      नोट: सावधान रहें कि पीबीएस और लगानेवाला समाधान की महाप्राण करते समय हाइड्रोगेल को पिपेट में न खींचें। प्लेट को ~ 45 डिग्री के कोण पर टिपकर ऐसा करें, जो हाइड्रोगेल को देखने और आकस्मिक आकांक्षा को रोकने में सहायता करेगा।
      सावधानी: फॉर्मलडिहाइड साँस लेना और संपर्क पर विषाक्त है। एक रासायनिक धूआं हुड में दस्ताने के साथ संभाल।
    4. कोशिकाओं को दागने के लिए, एंटीबॉडी के 1:200 के कमजोर पड़ने पर नेस्टिन (200 माइक्रोग्राम / एमएल) और एसओएक्स 2 (200 माइक्रोग्राम / एमएल) के लिए प्राथमिक एंटीबॉडी के साथ हाइड्रोजेल-इनकैप्सुलेटेड स्फेरॉइड को इनक्यूबेट करें: पीबीएस। कुओं से 1x पीबीएस महाप्राण करने के लिए एक 1000 माइक्रोन विंदुक का प्रयोग करें. प्रत्येक अच्छी तरह से पतला एंटीबॉडी के 50 माइक्रोन जोड़ें। धुंधला पूरा किया जा करने के लिए 24 घंटे की अनुमति दें. फिर, 1000 माइक्रोन विंदुक का उपयोग करके धुंधला समाधान हटा दें और कचरे को उचित रूप से त्याग दें।
    5. हाइड्रोजेल को डूबने के लिए पर्याप्त है जो 1xPBS के 500 माइक्रोन जोड़ने के लिए 1000 माइक्रोन विंदुक का उपयोग करें। पीबीएस को महाप्राण करें और इसे दो बार दोहराएं। इमेजिंग या छवि से पहले 2 सप्ताह के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 1x पीबीएस में दाग और जलमग्न हाइड्रोजेल को स्टोर करें।
      नोट: उचित धुंधला सुनिश्चित करने के लिए एंटीबॉडी के आधार पर मामूली अनुकूलन की आवश्यकता हो सकती है। एकाग्रता (1:200) और समय (24 घंटे) ठेठ 2 डी मोनोलेयर सेल संस्कृति की तुलना में काफी अधिक हैं क्योंकि 3 डी धुंधला हाइड्रोजेल और स्फेरोइड के माध्यम से प्रसार की आवश्यकता होती है।
  2. स्फेरॉइड धुंधला होने के बाद, फॉर्मामाइड (वैकल्पिक) की अनुक्रमिक एकाग्रता वृद्धि के साथ पीबीएस की जगह इमेजिंग के लिए पारदर्शिता में सुधार करने के लिए गोलाकार को साफ़ करें।
    1. प्रत्येक अच्छी तरह से 1x पीबीएस महाप्राण. प्रत्येक अच्छी तरह से 20% (वी / वी) फॉर्मामाइड के 500 माइक्रोन जोड़ें और हाइड्रोजेल को 90 मिनट के लिए इनक्यूबेट करने की अनुमति दें। 1000 माइक्रोन विंदुक का उपयोग करके फॉर्मामाइड को महाप्राण करें और कचरे को एक अपशिष्ट कंटेनर में इकट्ठा करें।
    2. कुएं में 40% (वी / वी) फॉर्ममाइड के 500 माइक्रोन जोड़ें। हाइड्रोजेल को 90 मिनट के लिए समाधान में इनक्यूबेट करने की अनुमति दें। फॉर्मामाइड को एस्पिरेट करें और कचरे को अपशिष्ट कंटेनर में इकट्ठा करें।
    3. प्रत्येक अच्छी तरह से 80% वी / वी फॉर्मामाइड के 500 माइक्रोन जोड़ें और 90 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें। फॉर्मामाइड को एस्पिरेट करें और अपशिष्ट कंटेनर में निपटाएं। फॉर्मामाइड के 100% (वी / वी) के 500 माइक्रोन जोड़ें और इमेजिंग से पहले 24 घंटे इनक्यूबेशन की अनुमति दें। जब समाशोधन समाप्त हो जाता है, तो प्रयोगशाला अपशिष्ट प्रबंधन प्रणाली की उपयुक्त सेवाओं के माध्यम से फॉर्मामाइड कचरे का ठीक से निपटान करें।
      नोट: समाशोधन स्फेरॉइड के मूल में फोकल इमेजिंग के लिए अनुमति देता है और वैकल्पिक है यदि केवल गोलाकार आकृति की परिधि की जांच की जा रही है।
  3. "कंफोकल माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके हाइड्रोजेल-इनकैप्सुलेटेड स्फेरॉइड की इमेजिंग"।
    नोट: किसी भी माइक्रोस्कोप - उल्टे, फ्लोरोसेंट, या कॉन्फोकल - सेल इमेजिंग के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है; हालांकि, कॉन्फोकल एकल विमानों के अलगाव की अनुमति देता है।
    1. ग्लास coverslip बोतलों के साथ chambered कुओं में hydrogels प्लेस और संभव के रूप में coverslip के करीब के रूप में spheroids स्थिति.
      नोट: ग्लास कवरस्लिप बॉटम्स के साथ ग्लास कवरस्लिप या चैम्बर वाले कुओं का उपयोग किया जा सकता है। हाइड्रोजेल को हाइड्रेटेड रखना महत्वपूर्ण है क्योंकि निर्जलित नमूनों के परिणामस्वरूप खराब इमेजिंग गुणवत्ता होगी।
    2. छवि एक लंबे समय से काम दूरी उद्देश्य (10x-20x) के साथ नमूने 3 डी पुनर्निर्माण के लिए जेड ढेर का उपयोग कर अंडाकार आकृति में गहरी इमेजिंग के लिए अनुमति देने के लिए.
      नोट: उच्च आवर्धन उद्देश्यों अधिक विस्तृत इमेजिंग और ऑप्टिकल सेक्शनिंग की अनुमति देते हैं लेकिन छवि गहराई का त्याग करते हैं।
    3. समीकरण 2 का उपयोग करके साफ़ और अस्पष्ट संकेत दोनों के लिए गोलाकार के कुल क्षेत्र के सापेक्ष ऑप्टिकल अनुभाग में मौजूद संकेत की मात्रा निर्धारित करें।
      Equation 2 समीकरण 2

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Representative Results

कीमोथेरेपीटिक प्रभावों का अध्ययन करने के लिए स्फेरोइड-आधारित ड्रग स्क्रीनिंग प्लेटफॉर्म देशी ऊतक की नकल करने वाले बायोमैटेरियल्स में स्फेरॉइड एनकैप्सुलेशन पर ट्यूमर माइक्रोएन्वायरमेंट को संशोधित करने पर जोर देने के कारण तेजी से मांग की जाती है। यहां हमने बहुकोशिकीय ट्यूमर स्फेरॉइड तैयारी और बाद में एनकैप्सुलेशन और इमेजिंग के लिए एक 3 डी हाइड्रोजेल में एक विधि विकसित की। स्फेरॉइड माइक्रोवेल मोल्ड्स (चित्रा 3ए, बी)में तैयार किए जाते हैं, जिसके परिणामस्वरूप गोलाकार आकार और कसकर नियंत्रित पॉलीडिस्पर्सिटी के साथ स्फेरॉइड होते हैं। उदाहरण के लिए, माइक्रोवेल प्रति 3,300 कोशिकाओं के साथ स्फेरॉइड के लिए, औसत गोलाकार आकृति का आकार ~ 250 माइक्रोन था, और परिपत्रता >0.8 थी, जहां 1 एक आदर्श क्षेत्र(चित्रा 3सी,डी)है। अंडाकार व्यास के लिए विचरण (% सीवी) का प्रतिशत गुणांक 19.3% था, और परिपत्रता के लिए% सीवी 4.5% था। स्फेरॉइड व्यास माइक्रोवेल प्रति कोशिकाओं की संख्या पर निर्भर थे, जैसा कि तालिका 1में दिखाया गया है। ध्यान दें कि माइक्रोवेल्स में कुछ कोशिकाओं को गोलाकार में शामिल नहीं किया जा सकता है और गोलाकार कटाई चरण के दौरान धोया जाएगा।

अंडाकार आकृति जेड ढेर (चित्रा 4) के भीतर प्रत्येक स्थान के लिए सेल व्यवहार्यता के लिए अनुमति देता है, अलग जेड ढेर गहराई पर imaged करने में सक्षम है. ध्यान दें कि कॉन्फोकल इमेजिंग सीमाओं और उच्च सेल घनत्व के कारण, स्फेरॉइड कोर को पूरी तरह से इमेज नहीं किया जा सका। जैसा कि बाद में चर्चा की, गोलाकार समाशोधन या सेक्शनिंग पूरे गोलाकार भर में बेहतर इमेजिंग के लिए आवश्यक हो सकता है. इस विधि के माध्यम से, अंडाकार आकृति व्यवहार्यता तुरंत फसल और encapsulation के बाद उच्च (~ 90%) होने के लिए निर्धारित किया गया था, भले ही सेल व्यवहार्यता परिधि की तुलना में अंडाकार आकृति कोर में 85% करने के लिए थोड़ा डूबा हुआ है. पूरे गोलाकार में व्यवहार्यता सुनिश्चित करने के लिए, एक्यूटेज का उपयोग करके स्फेरॉइड को अलग कर दिया गया था, और अलग-अलग कोशिकाओं की व्यवहार्यता की गणना उसी विधि का उपयोग करके की गई थी और समान रूप से उच्च (>90%) पाया गया था। अंडाकार आकृति ढेर का उपयोग एक अधिकतम प्रक्षेपण जेड ढेर एक छवि (चित्रा 4 बी) में संकुचित के प्रत्येक स्थान के भीतर प्रकाश तीव्रता के उच्चतम बिंदु का प्रतिनिधित्व करता है.

फ्री-फ्लोटिंग स्फेरॉइड (कोई जेल नहीं) और इनकैप्सुलेटेड स्फेरॉइड (पीईजी जेल) की प्रतिनिधि छवियां स्टेमनेस मार्कर नेस्टिन और एसओएक्स 2 के लिए दाग चित्रा 5में दिखाए गए हैं। नेस्टिन एक मध्यवर्ती फिलामेंट और ग्लियोमास में मौजूद एक स्टेम सेल मार्कर है। SOX2 स्व-नवीनीकरण के लिए एक प्रतिलेखन कारक है, जो ग्लियोमास में भी मौजूद है। SOX2 को नाभिक में DAPI के साथ सह-स्थानीयकृत पाया गया, जबकि नेस्टिन पूरे कोशिकाओं में मौजूद था। डेटा जेल और कोई जेल की स्थिति के बीच कोई अंतर नहीं दिखाता है, संभवतः यहां इस्तेमाल किए जाने वाले पीईजी जेल के निष्क्रिय होने और इंटीग्रिन सिग्नलिंग के माध्यम से सेल-मैट्रिक्स इंटरैक्शन की सुविधा नहीं होने के कारण।

इमेजिंग की एक प्रमुख सीमा उच्च गोलाकार घनत्व है, जिससे स्फेरॉइड कोर में छवि बनाना मुश्किल हो जाता है। अंडाकार आकृति कोर छवि के लिए सामान्य तरीकों वर्गों सेक्शनिंग और समाशोधन शामिल हैं. यह फ्री-फ्लोटिंग स्फेरॉइड के साथ अच्छी तरह से काम कर सकता है, लेकिन हाइड्रोगेल को सेक्शनिंग करना मुश्किल है, और अधिकांश ऊतक समाशोधन में निर्जलीकरण नमूने शामिल हैं, जिसके परिणामस्वरूप विकृत नमूने होते हैं। यहाँ हम स्फेरॉइड समाशोधन करते हुए अंडाकार संरचना को बनाए रखने के लिए हाइड्रोजेल नमूनों के लिए Kuwajima एट al.28 से एक प्रोटोकॉल अनुकूलित. समाशोधन विधि की उपयोगिता का प्रदर्शन करने के लिए, spheroids तय किया गया, पीआई के साथ दाग, और (चित्रा 6) मंजूरी दे दी. चित्रा 6 ए साफ और अस्पष्ट गोलाकार में ~ 90 माइक्रोन पर ऑप्टिकल वर्गों की प्रतिनिधि छवियों को दिखाता है और गोलाकार क्षेत्र भरने पर अंडाकार आकृति का कुल क्षेत्रफल। समाशोधन प्रदर्शन किया गया था, तो एक अस्पष्ट गोलाकार (चित्रा 6बी)की तुलना में अंडाकार आकृति कोर ~ 30 माइक्रोन गहरा imaged किया जा सकता है. समाशोधन इम्यूनोफ्लोरेसेंस के लिए बहुत फायदेमंद हो सकता है, क्योंकि बायोमार्कर के स्थानिक संगठन का विश्लेषण स्फेरोइड्स के मूल में किया जा सकता है। इस विधि का उपयोग केवल निश्चित नमूनों के लिए किया जा सकता है क्योंकि झिल्ली अखंडता बाधित होती है।

Figure 1
चित्रा 1: पीडीएमएस मोल्ड निर्माण और गोलाकार गठन। पीडीएमएस अग्रदूत समाधान पीडीएमएस मोल्ड बनाने के लिए वर्ग पिरामिड माइक्रोवेल प्लेटों में जोड़े जाते हैं। विघटित सेल निलंबन गठित पीएमडीएस नए नए साँचे में जोड़ा जाता है और 24 घंटे के बाद अंडाकार आकृति के गठन के लिए अनुमति देने के लिए नीचे काता जाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 2
चित्रा 2: हाइड्रोजेल एनकैप्सुलेशन, संवर्धन और इमेजिंग। (ए) 4-आर्म पीईजी-एसी, पीईजी डीआईएसएच, और स्फेरॉइड सस्पेंशन को माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब में जोड़ा जाता है और (बी) जेल अग्रदूत समाधान बनाने के लिए ऊपर और नीचे पाइपिंग द्वारा अच्छी तरह मिलाया जाता है। (सी) जेल अग्रदूत समाधान के 20 माइक्रोन को ग्लास स्लाइड पर पाइप किया जाता है, और एक दूसरी ग्लास स्लाइड को समाधान के शीर्ष पर रखा जाता है और 1 मिमी स्पेसर्स द्वारा अलग किया जाता है। (डी) हाइड्रोजेल को 24 अच्छी प्लेटों में स्थानांतरित किया जाता है जिसमें स्फेरॉइड का सामना करना पड़ता है और मीडिया (500 माइक्रोन) के साथ कवर किया जाता है। (ई) हाइड्रोजेल को माइक्रोस्कोपी इमेजिंग के लिए एक ग्लास कवरस्लिप में स्थानांतरित किया जाता है। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्रा 3: फसल से पहले microwells में गोफरूइड गठन, microwells में प्रारंभिक सेल बोने के बाद 24 घंटे. (ए) DiOC (हरा) के साथ दाग माइक्रोवेल में गोलाकार. स्केल बार 200 माइक्रोन है। (बी) माइक्रोवेल्स में स्फेरॉइड की ब्राइटफील्ड छवि। (सी) माइक्रोवेल्स में अंडाकार आकृति व्यास का हिस्टोग्राम। (डी) माइक्रोवेल्स में गोलाकार परिपत्र का हिस्टोग्राम। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्रा 4: लाइव मृत विश्लेषण के लिए लाइव स्फेरॉइड की प्रतिनिधि जेड-स्टैक कॉन्फोकल छवि। (ए) डीआईओसी (हरा) और पीआई (लाल) के साथ जेड-स्टैक के 4 स्लाइस से छवियां। स्केल बार 200 माइक्रोन है। (बी) जेड-स्टैक का अधिकतम प्रक्षेपण। (सी) गोलाकार गहराई के एक समारोह के रूप में सेल व्यवहार्यता। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 5
चित्रा 5: संस्कृति के दिन 5 पर फ्री-फ्लोटिंग (कोई जेल) और हाइड्रोजेल-एनकैप्सुलेटेड (पीईजी जेल) यू 87 सेल स्फेरॉइड के नेस्टिन और एसओएक्स 2 इम्यूनोस्टेनिंग। स्फेरॉइड की प्रतिनिधि कॉन्फोकल छवियां नेस्टिन (लाल) और एसओएक्स 2 (हरी) अभिव्यक्ति की पुष्टि करती हैं, जो डीएपीआई (नीला; नाभिक) के साथ प्रतिकृति थीं। स्केल बार 100 माइक्रोन है। सफेद वर्ग से क्रॉप और ज़ूम की गई छवियां नाभिक (नीला) और SOX2 (हरा) के बीच संबंध दिखाती हैं। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 6
चित्रा 6: मंजूरी दे दी स्फेरॉइड की इमेजिंग गहराई. (ए)गोलाकार और कुल गोलाकार क्षेत्र में 91.6 माइक्रोन पर imaged spheroids के प्रतिनिधि छवियों. (B) अंडाकार क्षेत्र का प्रतिशत जो अगोलाकार में गहराई के रूप में दर्शाया जाता है, बढ़ जाती है। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

माइक्रोवेल आकार (माइक्रोन) प्रति स्फेरॉइड कोशिकाओं की संख्या प्रति अच्छी तरह से कोशिकाओं की संख्या सेल एकाग्रता (कोशिकाओं / गोलाकार व्यास (μm)
400 200 120000 240000 115.4 ± 13.5
500 300000 600000 144.6 ± 14.3
1000 600000 1200000 176.5 ± 12.5
800 2000 300000 600000 212.4 ± 15.7
3000 450000 900000 258.9 ± 16.3
4000 600000 1200000 305.7 ± 21.6
5000 750000 1500000 323.4 ± 29.8

तालिका 1: स्पेरॉइड व्यास और माइक्रोवेल आकार। स्फेरॉइड प्रति कोशिकाओं की गणना संख्या, 48-अच्छी तरह से प्लेट, सेल एकाग्रता, और परिणामस्वरूप नकारात्मक पीडीएमएस मोल्ड के माइक्रोवेल आकार के आधार पर अच्छी तरह से कोशिकाओं की संख्या।

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Discussion

हाइड्रोजेल आधारित बहुकोशिकीय ट्यूमर गोलाकार मॉडल तेजी से कैंसर चिकित्सीय खोजों 11,13,29 अग्रिम करने के लिए विकसित किया जा रहा है. वे फायदेमंद हैं क्योंकि वे ट्यूमर माइक्रोएन्वायरमेंट के प्रमुख मापदंडों को नियंत्रित तरीके से अनुकरण करते हैं और उनकी जटिलता के बावजूद, विवो मॉडल की तुलना में उपयोग करने के लिए सरल और सस्ता हैं, और कई उच्च-थ्रूपुट स्क्रीनिंग तकनीकों के साथ संगत हैं। हाइड्रोजेल बायोमैटेरियल्स को ट्यूमर बाह्य मैट्रिक्स का अनुकरण करने और सेल-मैट्रिक्स इंटरैक्शन को सुविधाजनक बनाने के लिए ट्यून किया जा सकता है, और स्फेरॉइड (विघटित कोशिकाओं के विपरीत) देशी ट्यूमर के सेल-सेल इंटरैक्शन का अनुकरण करता है। सिंथेटिक हाइड्रोगेल, जैसा कि यहां दिखाया गया है, विशेष रूप से फायदेमंद हैं क्योंकि हाइड्रोजेल वांछित संरचनात्मक समर्थन और भौतिक और यांत्रिक गुण प्रदान करता है, जबकि चिपकने वाला लिगैंड या डिग्रेडेबल अनुक्रमों का उपयोग स्वतंत्र रूप से जैव रासायनिक सामग्री गुणों को ट्यून करने के लिए किया जा सकता है। सिंथेटिक हाइड्रोगेल भी कम बैच-टू-बैच परिवर्तनशीलता और भौतिक गुणों की अधिक रेंज प्रदान करते हैं, जिसमें शरीर में सबसे नरम ऊतक शामिल होते हैं।

यहां, हम एक निष्क्रिय खूंटी-आधारित हाइड्रोजेल के उपयोग का विस्तार से वर्णन करते हैं जो माइकल-प्रकार के जोड़ के माध्यम से बनता है जैसा कि पहले25,30 वर्णित है। यहां उपयोग किए जाने वाले प्रतिनिधि पीईजी हाइड्रोजेल में ~ 8 केपीए का यंग मापांक है, जो ग्लियोब्लास्टोमा ऊतक कठोरता9 के समान है। खूंटी हाइड्रोजेल सुविधाजनक है क्योंकि इसमें ट्यून करने योग्य गुण और अत्यधिक विशिष्ट जेलेशन रसायन विज्ञान है और सेल व्यवहार्यता (चित्रा 4) से समझौता किए बिना स्फेरॉइड की उपस्थिति में बनाया जा सकता है। जबकि खूंटी हाइड्रोजेल निष्क्रिय है और परिभाषित भौतिक और यांत्रिक गुणों के साथ सेल मचान के रूप में कार्य करता है, सेल चिपकने वाला लिगेंड सेल-मैट्रिक्स इंटरैक्शन को निर्देशित करने के लिए जोड़ा जा सकता है, और एंजाइमेटिक रूप से डिग्रेडेबल पेप्टाइड क्रॉसलिंकर्स को मैट्रिक्स रीमॉडेलिंग9 की सहायता के लिए जोड़ा जा सकता है। चिपकने वाले लिगैंड और पेप्टाइड क्रॉसलिंकर्स को मॉडल में शारीरिक या रोग संबंधी प्रासंगिकता जोड़ने के लिए सेलुलर माइक्रोएन्वायरमेंट का अनुकरण करने के लिए चुना जा सकता है। हाइड्रोजेल सड़नशीलता, यांत्रिक गुणों और चिपकने के लिए खूंटी हाइड्रोजेल संशोधनों के बारे में अधिक जानकारी के लिए, पाठकों को निम्नलिखित प्रकाशित कार्य 9,27 के लिए संदर्भित किया जाता है।

यहाँ वर्णित विधि का उपयोग करना, कैंसर spheroids की बड़ी मात्रा जल्दी से गठन किया जा सकता है और खूंटी हाइड्रोजेल में encapsulated अन्य गुणों के बीच अंडाकार कोशिका व्यवहार्यता, आकारिकी, या सेल स्टेम (चित्रा 4 और चित्रा 5) पर सब्सट्रेट गुणों के प्रभाव का पता लगाने के लिए. कोशिकाओं को पहले एकत्र करने और एक गोलाकार बनाने की अनुमति दी जाती है और फिर हाइड्रोगेल में समझाया जाता है, जैसा कि चित्र 2 और चित्र 3 में दिखाया गया है। एकत्रीकरण प्रक्रिया माइक्रोवेल मोल्ड्स के आकार और माइक्रोवेल मोल्ड्स (तालिका 1) में पाइप किए गए सेल निलंबन की एकाग्रता के आधार पर गोलाकार आकार को बदलने में सक्षम बनाती है। परिणामी स्फेरॉइड आकार में अपेक्षाकृत मोनोडिस्पर्स होते हैं, सभी स्थितियों के लिए ~ 10% -20% के विचरण के औसत गुणांक के साथ। यह अनुप्रयोगों की एक किस्म के लिए फायदेमंद है, के रूप में समान आकार समान प्रसार सीमाओं का प्रदर्शन होगा, यह दवाओं, पोषक तत्वों, या ऑक्सीजन के हो, गोलाकार में. स्फेरॉइड भी अन्य अल्ट्रा कम लगाव या फांसी ड्रॉप31 के लिए तुलनीय है जो >0.8, की एक परिपत्र है. ध्यान दें कि गोलाकार गठन के लिए अन्य तरीकों का उपयोग पहले किया जा सकता है, जैसे फांसी ड्रॉप विधि या रोटरी सेल संस्कृति प्रणाली32, और फिर हाइड्रोजेल में समझाया गया। हालांकि, यहां वर्णित विधि के लिए किसी विशेष उपकरण या महंगी उपभोग्य सामग्रियों की आवश्यकता नहीं है, इसलिए, सभी प्रयोगशालाओं के लिए पहुंच में सहायता करना।

जबकि यहां दिखाए गए तरीके U87-MG ग्लियोब्लास्टोमा सेल लाइन का उपयोग करते हैं, वर्णित स्फेरॉइड फैब्रिकेशन और एनकैप्सुलेशन विधि का उपयोग विभिन्न कैंसर सेल प्रकारों के लिए किया जा सकता है जो ठोस ट्यूमर बनाते हैं। यदि कोशिकाएं आसानी से एक गोलाकार बनाने के लिए एकत्रित नहीं होती हैं, तो ईसीएम प्रोटीन का मिश्रण, जैसे कि तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स, प्रक्रिया में सहायता के लिए सेल निलंबन में जोड़ा जा सकता है (जैसा कि विधियों में वर्णित है)। एक बार spheroids समझाया रहे हैं, यह imaged और हाइड्रोजेल में सीधे विश्लेषण के बजाय hydrogel या कोशिकाओं अलग किया जा रहा से निकाला जा रहा है विश्लेषण किया जा रहा है. ऐसा इसलिए है क्योंकि स्फेरॉइड आमतौर पर विषम होते हैं (उदाहरण के लिए, ऑक्सीजन और पोषक तत्वों के ग्रेडिएंट के कारण एक हाइपोक्सिक कोर बन सकता है), और सेल प्रतिक्रियाएं स्फेरॉइड के भीतर की स्थिति के आधार पर भिन्न होंगी। इसके अलावा, सेल निष्कर्षण अंडाकार आकृति भाग्य पर सेल मैट्रिक्स बातचीत की भूमिका अस्पष्ट हो सकता है. उदाहरण के लिए, हमने पहले दिखाया है कि स्फेरॉइड परिधि बनाम कोर में कोशिकाओं में कीमोथेरेप्यूटिक्स के लिए अलग-अलग जवाबदेही होती है, जो सब्सट्रेट27 के यांत्रिक गुणों पर निर्भर है। इसलिए, हम गोलाकार व्यवहार के अध्ययन के लिए माइक्रोस्कोपी तकनीक का उपयोग करने की सिफारिश, के रूप में इस पांडुलिपि में प्रकाश डाला.

एक मुद्दा पर विचार करने के लिए जब इस तरह के spheroids के रूप में घने ऊतकों इमेजिंग उनकी अस्पष्टता है. यहाँ हम अंडाकार आकृति (चित्रा 6) के इंटीरियर के माध्यम से imageability में सुधार करने के लिए एक समाशोधन विधि का वर्णन. हालांकि, भले ही इमेजिंग गहराई को अधिकतम करने में गोलाकार समाशोधन एड्स, सीमाओं को पाया जा सकता है जब संभावित संरचनात्मक क्षति में जिसके परिणामस्वरूप formamide में समझाया spheroids रखने, और अंडाकार आकृति आकृति प्रभावकारिता को प्रभावित. यह प्रक्रिया भी जीवित / मृत धुंधला के माध्यम से सेल व्यवहार्यता अवलोकन जब प्रदर्शन नहीं किया जा सकता है क्योंकि समाशोधन निर्धारण की आवश्यकता है. समाशोधन प्रक्रिया को धुंधला होने के बाद फॉर्ममाइड में कई घंटों के इनक्यूबेशन की भी आवश्यकता होती है, इसलिए यह संभावित रूप से उपयोग किए जा रहे रंगों को प्रभावित कर सकता है। क्रायोसेक्शनिंग और फिर इम्यूनोस्टेनिंग जैसी अन्य तकनीकें भी काम कर सकती हैं, बशर्ते कि सेक्शनिंग स्फेरॉइड ऊतक अखंडता को विकृत या समझौता न करे। हमारे हाथों में, क्रायोसेक्शनिंग के परिणामस्वरूप हाइड्रोजेल की कोमलता के कारण "स्क्विश्ड" स्फेरॉइड हुए, जो कि यंग के मापांक में ~ 8 kPa है, ग्लियोब्लास्टोमा ऊतक कठोरता का अनुकरण करने के लिए।

कुल मिलाकर, इस प्रोटोकॉल में महत्वपूर्ण कदम सफल गोलाकार निर्माण, हाइड्रोजेल एनकैप्सुलेशन और संस्कृति, और गोलाकार इमेजिंग और विश्लेषण हैं; इसलिए, हमने उन चरणों के लिए नोट्स और समस्या निवारण रणनीतियाँ प्रदान की हैं। यहां वर्णित हाइड्रोजेल-एनकैप्सुलेटेड स्फेरॉइड का उपयोग विभिन्न प्रकार के अनुप्रयोगों में किया जा सकता है, जैसे कि ड्रग स्क्रीनिंग प्लेटफॉर्म, सेल-मैट्रिक्स इंटरैक्शन के विस्तृत अध्ययन और सेल व्यवहार पर उनका प्रभाव, रोग एटियलजि का अध्ययन आदि। इस तरह के अध्ययनों को वर्णित प्रणाली की ट्यूनबिलिटी द्वारा सहायता प्रदान की जा सकती है जैसा कि ऊपर चर्चा की गई है और सिंथेटिक पीईजी हाइड्रोजेल के अनुमानित और नियंत्रणीय गुणों को देखा जा सकता है। वर्णित प्रणाली की कुछ सीमाओं में एक मध्यम थ्रूपुट शामिल है, जहां मल्टीप्लेक्स या उच्च मात्रा वाले अध्ययन जैसे ड्रग स्क्रीनिंग के लिए उच्च थ्रूपुट बेहतर है। एक और सीमा इमेजिंग की आवश्यकता है, जैसे कि डेटा विश्लेषण के लिए कॉन्फोकल इमेजिंग। जबकि इमेजिंग विस्तृत विशेष और लौकिक विश्लेषण के लिए अनुमति देता है, यह भी समय लेने वाली है और गहराई और गोलाकार आकृति कोशिका घनत्व के कारण प्रवेश सीमाओं से बाधा है.

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है।

Acknowledgments

इस काम को सेंट लुइस विश्वविद्यालय द्वारा डॉ सिल्विया पी जुस्तियाक को प्रदान किए गए स्टार्ट-अप फंड के साथ-साथ सेंट लुइस विश्वविद्यालय में हेनरी और अमेलिया नसरल्लाह सेंटर फॉर न्यूरोसाइंस से बीज अनुदान द्वारा वित्त पोषित किया गया था, जिसे डॉ सिल्विया पी जुस्तिक को सम्मानित किया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
70% Ethanol Fisher Scientific  LC22210-4
15 mL Conicals FALCON 352097
24-Well Plate Ultra Low Attachment plates Fisher Scientific 07-200-602
35 mm Petri Dish Amazon 706011
4-arm poly(ethylene glycol)-acrylate (4-arm PEG-Ac; 10 kDa) Laysan Bio ACRL-PEG-ACRL-10K-5g
50 mL Conicals Fisher Scinetific 3181345107
6-well AggreWell 400  StemCell Technologies, Vancouver, Canada 34421 Square pyramidal microwells 
anti-adherence rinsing solution StemCell Technologies, Vancouver, Canada Cat #: 07010
Aspartic Acid-Arginine-Cysteine-Glycine-Valine-Proline-Methionine-Serine-Methionine-Arginine-Glycine-Cysteine-Arginine- Aspartic Acid (DRCG-VPMSMR-GCRD) peptide Genic Bio, Shanghai, China n/a Custom synthesis
Chemical Fume Hood KEWAUNEE 99151
Corning Matrigel Basement Membrane Matrix, LDEV Free  Corning 356234 Basement membrane matrix
Detergent - Triton-X Sigma Aldrich T8787 Nonionic surfactant
Dimethyl sulfoxide (DMSO) Fisher Scientific  BP231-100
Disposable Pipettes (1 mL, 2 mL, 5 mL, 10 mL, 25 mL, 50 mL) Fisher Scinetific 1 mL: 13-678-11B, 2mL: 05214038, 5mL(FALCON): 357529, 10mL: 13-678-11E, 25mL: 13-678-11, 50mL: 13-678-11F
Fetal Bovine Serum HyClone SH30073-03
Formaldehyde 37% Solution Sigma Aldrich F1635
Glass Plates Slumpys GBS4100SFSL
Glass Transfer Pipettes Fisher Scinetific 5 3/4": 1367820A, 9":136786B
Glycine-Arginine-Cysteine-Aspartic Acid-Arginine-Glycine-Aspartic Acid-Serine (GRCD-RGDS) peptide Genic Bio, Shanghai, China n/a Custom synthesis
Hemacytometer Bright-Line 383684
Hydrophobic solution - Repel Silane  GE Healthcare Bio-Sciences 17-1332-01
Incubator NUAIRE NU-8500
Inverted Microscope (Axiovert 25) Zeiss 663526
Invitrogen DiOC16(3) (3,3'-Dihexadecyloxacarbocyanine Perchlorate) Fisher Scientific  D1125
Leica Confocal SP8 Leica Microsystems Inc.
Light and Flourescent Microscope (Axiovert 200M) Zeiss 3820005619
Micro centrifuge tubes Fisher Scientific 2 mL: 02681258
Microscope Software Zeiss AxioVision Rel. 4.8.2
Nestin Alexa Fluor 594  Santa Cruz Biotechnology sc-23927
Parafilm PARAFILM  PM992
PBS (1x), pH 7.4 HyClone SH30256.01
Penicillin Streptomycin MP Biomedicals 1670046
Pipette Aid Drummond Scientific Co. P-76864
Pipette Tips (1–200 µL, 101–1000 µL) Fisher Scinetific 2707509
Plastic Standard Disposable Transfer Pipettes Fisher Scientific 13-711-9D
Plastic Weigh Boats (100 mL) Amazon  mdo-azoc-1030
poly(ethylene glycol)-dithiol (PEG-diSH; 3.4 kDa) Laysan Bio SH-PEG-SH-3400-5g
Polydimehylsiloxane (PDMS) [Slygard 182 Elastomer Kit] Elsworth Adhesives 3097358-1004 Polydimethylsiloxane
Powder Free Examination Gloves Quest 92897
Propidium iodide, 1 mg/mL aqueous soln.  Fisher Scientific  AAJ66584AB
RPMI-1640 Medium (1x) HyClone SH30027-02
Silicone spacers - Silicone sheet, 0.5 mm thick/13 cm x 18 cm Grace Bio-Labs JTR-S-0.5
SOX2 Alexa Fluor 488  Santa Cruz Biotechnology sc-365823
Tissue Culture Hood NUAIRE NU-425-600
Triethanolamine, ≥99.0% (GC)  Sigma Aldrich 90279
U-87 MG human glioblastoma cells American Type Culture Collection  HTB-14

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References

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