Waiting
로그인 처리 중...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

تصنيع وتغليف كروي للورم في الهلاميات المائية المصنوعة من البولي إيثيلين جلايكول لدراسة تفاعلات المصفوفة الكروية

Published: September 22, 2023 doi: 10.3791/65515
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Biomedical Engineering Department, Saint Louis University

Summary

هنا ، نقدم بروتوكولا يتيح التصنيع السريع والقوي والرخيص للكرويات السرطانية متبوعا بتغليف الهيدروجيل. إنه قابل للتطبيق على نطاق واسع لأنه لا يتطلب معدات متخصصة. سيكون مفيدا بشكل خاص لاستكشاف تفاعلات المصفوفة الكروية وبناء فسيولوجيا الأنسجة المختبرية أو نماذج علم الأمراض.

Abstract

يعد التغليف ثلاثي الأبعاد (3D) للكرويات أمرا بالغ الأهمية لتكرار البيئة المكروية للورم بشكل كاف لتحقيق النمو الأمثل للخلايا. هنا ، قمنا بتصميم نموذج الورم الأرومي الدبقي 3D في المختبر لتغليف كروي لتقليد البيئة المكروية خارج الخلية للورم. أولا ، قمنا بتشكيل قوالب microwell هرمية مربعة باستخدام polydimethylsiloxane. ثم تم استخدام قوالب microwell هذه لتصنيع كرويات الورم بأحجام يتم التحكم فيها بإحكام من 50-500 ميكرومتر. بمجرد تكوين الأجسام الكروية ، تم حصادها وتغليفها في الهلاميات المائية القائمة على البولي إيثيلين جلايكول (PEG). الهلاميات المائية PEG هي منصة متعددة الاستخدامات لتغليف كروي ، حيث يمكن ضبط خصائص الهيدروجيل مثل الصلابة والتحلل والالتصاق الخلايا بشكل مستقل. هنا ، استخدمنا هيدروجيل ناعم تمثيلي (~ 8 كيلو باسكال) لتغليف كرويات الورم الأرومي الدبقي. أخيرا ، تم تطوير طريقة لتلطيخ وصور كرويات للحصول على صور عالية الجودة عبر الفحص المجهري متحد البؤر. نظرا للنواة الكروية الكثيفة والأطراف المتناثرة نسبيا ، قد يكون التصوير صعبا ، ولكن استخدام محلول المقاصة والتقسيم البصري متحد البؤر يساعد في تخفيف صعوبات التصوير هذه. باختصار ، نعرض طريقة لتصنيع كرويات موحدة ، وتغليفها في الهلاميات المائية PEG وإجراء الفحص المجهري متحد البؤر على الكرات المغلفة لدراسة نمو الكروية وتفاعلات مصفوفة الخلية المختلفة.

Introduction

ظهرت كرويات الورم على أنها مفيدة في الأدوات المختبرية في دراسة مسببات السرطان وعلم الأمراض والاستجابة للأدوية1. تقليديا ، تم استزراع الكائنات الكروية في ظروف مثل ألواح الالتصاق المنخفضة أو المفاعلات الحيوية ، حيث يفضل التصاق الخلايا الخلوية على التصاق سطح الخلية2. ومع ذلك ، فمن المسلم به الآن أنه لتلخيص البيئة المكروية للورم بشكل أكثر إخلاصا ، يجب أن تلتقط النماذج الكروية في المختبر تفاعلات كل من الخلايا الخلوية ومصفوفة الخلايا. وقد دفع هذا مجموعات متعددة إلى تصميم سقالات ، مثل الهلاميات المائية ، حيث يمكن تغليف الأجسام الكروية 3,4. تتيح هذه النماذج الكروية القائمة على الهيدروجيل توضيح تفاعلات الخلايا والخلايا والمصفوفة على سلوكيات الخلايا المختلفة ، مثل الجدوى أو الانتشار أو الجذعية أو استجابة العلاج3.

هنا ، نصف بروتوكولا لتغليف كرويات الورم الأرومي الدبقي في الهلاميات المائية المصنوعة من البولي إيثيلين جلايكول (PEG). هناك العديد من التقارير الأدبية عن تغليف الخلايا الكروية للورم الأرومي الدبقي في الهلاميات المائية. على سبيل المثال ، تم تشكيل الكرات عن طريق تغليف خلايا U87 في الهلاميات المائية PEG المزينة برابط لاصق RGDS ومتشابك مع ببتيد قابل للانقسام الأنزيمي لتحديد تأثير صلابة الهيدروجيل على سلوك الخلية5. كما تم تشكيل خلايا U87 في الهلاميات المائية الأخرى القائمة على PEG أو حمض الهيالورونيك لتوسيع عدد الخلايا الجذعية السرطانية6 أو لاستكشاف آليات بوساطة المصفوفة لمقاومة العلاج الكيميائي7،8،9. كما تم تغليف كرويات الورم الأرومي الدبقي في الهلاميات المائية الجيلاتينية لدراسة الحديث المتبادل بين الخلايا الدبقية الصغيرة والخلايا السرطانية وتأثيرها على غزو الخلايا10. بشكل عام ، أظهرت هذه الدراسات فائدة النماذج المختبرية القائمة على الهيدروجيل في فهم أمراض الورم الأرومي الدبقي وابتكار العلاجات.

علاوة على ذلك ، هناك طرق مختلفة لتصنيع الورم الكروي وتغليف هيدروجيل11. على سبيل المثال ، يمكن زرع الخلايا المشتتة في الهلاميات المائية والسماح لها بتكوين كرويات بمرور الوقت 5,12. أحد عيوب هذه الطريقة هو تعدد تشتت الأجسام الكروية المشكلة ، مما قد يؤدي إلى استجابات الخلايا التفاضلية. لإنتاج كرويات موحدة ، يمكن تغليف الخلايا في الهلاميات الدقيقة وزراعتها لفترات طويلة حتى تغزو وتعيد تشكيل الجل13 ، أو يمكن إيداع الخلايا في مواد هلامية مقولبة مع "ثقوب" كروية ويسمح لها بتجميع14. عيب هذه الطرق هو تعقيدها النسبي ، والحاجة إلى مولد قطرات أو وسائل أخرى لتشكيل الهلاميات الدقيقة أو "الثقوب" في الجل ، والوقت الذي تستغرقه الكائنات الكروية لتنمو وتنضج. بدلا من ذلك ، يمكن تشكيل الأجسام الكروية مسبقا في الآبار الدقيقة9،15،16 أو في ألواح معلقة17،18 ثم تغليفها في هيدروجيل ، على غرار التقنية الموصوفة هنا. هذه الطرق أبسط ويمكن القيام بها بطريقة إنتاجية أعلى. ومن المثير للاهتمام ، أنه ثبت أن طريقة تكوين كروية يمكن أن تؤثر على سلوكيات الخلايا الكروية ، مثل التعبير الجيني أو تكاثر الخلايا أو استجابة الدواء19,20.

هنا ، نركز على الورم الأرومي الدبقي لأنه ورم صلب بيئته الأصلية هي مصفوفة الدماغ النانويةالناعمة 21 ، والتي يمكن محاكاتها بواسطة هيدروجيل مائي ناعم يسهل اختراقه. الورم الأرومي الدبقي هو أيضا أكثر أنواع سرطان الدماغ فتكا والذي لا يوجد علاج متاح له22. ومع ذلك ، يمكن استخدام البروتوكول الموضح هنا لتغليف الأجسام الكروية التي تمثل أي ورم صلب. اخترنا استخدام الهلاميات المائية PEG التي تتشكل من خلال تفاعل إضافة من نوع مايكل23. PEG هو هيدروجيل اصطناعي وغير قابل للتحلل ومتوافق حيويا خامل ويعمل كسقالات ودعم مادي للخلايا ولكنه لا يدعم ارتباط الخلية23. يمكن إضافة التصاق الخلية بشكل منفصل عن طريق ربط البروتينات الكاملة أو الروابط اللاصقة24 ، ويمكن إضافة قابلية التحلل عن طريق التعديلات الكيميائية لسلسلة بوليمر PEG أو الروابط المتشابكة القابلة للتحلل المائي أو الإنزيمي25,26. وهذا يسمح بضبط الخواص الكيميائية الحيوية بشكل مستقل عن خصائص الهيدروجيل الميكانيكية أو الفيزيائية ، والتي يمكن أن تكون مفيدة في دراسة تفاعلات مصفوفة الخلية. كيمياء الهلام من نوع مايكل انتقائية وتحدث في الظروف الفسيولوجية. وبالتالي ، فإنه يسمح بتغليف كروي ببساطة عن طريق خلط الكائنات الكروية مع محلول سلائف الهيدروجيل.

بشكل عام ، تتميز المنهجية المقدمة هنا بالعديد من الخصائص البارزة. أولا ، يعد تصنيع كرويات الورم في مجموعة متعددة الآبار فعالا وسريعا وتكلفة المواد المطلوبة منخفضة. ثانيا ، يتم إنتاج الأجسام الكروية على دفعات كبيرة في مجموعة متنوعة من الأحجام مع تعدد تشتت منخفض. أخيرا ، المواد المتاحة تجاريا فقط مطلوبة. تتضح فائدة المنهجية من خلال استكشاف تأثير خصائص الركيزة على صلاحية الخلايا الكروية والدائرية وجذع الخلية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. إعداد الحلول

  1. تحضير محلول السلائف بوليديميثيل سيلوكسان (PDMS)
    1. قم بإعداد محلول السلائف PDMS السلبي (يستخدم أيضا لمحلول سلائف الغراء). اغرف المطاط الصناعي في وعاء الوزن باستخدام ملعقة وقم بوزنه. أضف عامل المعالجة إلى قاعدة المطاط الصناعي بنسبة 1:10. امزج PDMS وعامل المعالجة برفق ودقة باستخدام الملعقة الموجودة في قارب الوزن البلاستيكي.
      ملاحظة: يتم سكب محلول سلائف PDMS هذا في لوحة microwell الهرمية المربعة المكونة من 6 آبار لتشكيل القالب السالب. هذا هو نفس الحل المستخدم في محلول سلائف الغراء.
    2. قم بإعداد حل السلائف PDMS الإيجابي. اغرف قاعدة المطاط الصناعي في وعاء الوزن باستخدام ملعقة وقم بوزنها. أضف عامل المعالجة إلى قاعدة المطاط الصناعي بنسبة 1: 9. امزج PDMS وعامل المعالجة برفق ودقة باستخدام الملعقة الموجودة في قارب الوزن البلاستيكي.
      ملاحظة: يتم سكب محلول السلائف PDMS هذا لاحقا على القالب السلبي لتشكيل القالب الموجب.
  2. تحضير محلول ثلاثي إيثانولامين 0.3 متر (TEA) من الرقم الهيدروجيني 8
    1. ماصة 1 مل من الشاي و 9 مل من 1x محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) إلى 50 مل مخروطي باستخدام ماصة مساعدة لإنشاء محلول TEA 0.75 M. قم بمعايرة المحلول إلى الرقم الهيدروجيني 8 باستخدام 1 N HCl أو 1 N NaOH. بعد ذلك ، أضف ما يكفي من 1x PBS لتحقيق حجم نهائي قدره 25 مل لتحقيق تركيز TEA النهائي البالغ 0.3 M مع درجة حموضة 8.
      تنبيه: قم بتخزين محاليل HCl و NaOH في خزانة قابلة للاشتعال في درجة حرارة الغرفة (RT). ارتداء معدات الحماية الشخصية عند المناولة.
  3. إعداد وسائط كاملة
    1. لتحضير الوسائط الكاملة ، أضف 10٪ (وزن / حجم) أو 56 مل من مصل الجنين البقري و 1٪ (وزن / حجم) أو 5.6 مل من البنسلين والستربتومايسين إلى 500 مل RPMI متوسط.
    2. ضع المحلول على حرارة 37 درجة مئوية لمدة 10-20 دقيقة أو حتى يصبح المحلول دافئا قبل الاستخدام.
    3. قم بتخزين المحلول في درجة حرارة 0-4 درجة مئوية لمدة تصل إلى 6 أشهر.
  4. تحضير 20٪ (وزن / حجم) حلول مخزون البولي إيثيلين جلايكول (PEG)
    ملاحظة: يعتمد الحساب على حلول 100 ميكرولتر التي يمكن زيادتها أو خفضها حسب الحاجة.
    1. لتحضير محلول مخزون سعة 100 ميكرولتر بنسبة 20٪ وزن / وزن 4 أذرع PEG-Acrylate (4 أذرع PEG-Ac) ، قم بوزن 20 مجم من مسحوق PEG-Ac رباعي الأذرع في أنبوب microfuge. أضف 70 ميكرولتر من محلول TEA 0.3 M ، ثم دوامة المحلول لمدة 30 ثانية أو حتى يذوب تماما. ضع في اعتبارك تغير الحجم بسبب إذابة المسحوق عن طريق إضافة ما يكفي من محلول TEA (~ 27 ميكرولتر) للوصول إلى حجم محلول نهائي يبلغ 100 ميكرولتر.
    2. لتحضير محلول مخزون سعة 100 ميكرولتر بنسبة 20٪ وزن / وزن PEG-diSH ، قم بوزن 20 مجم من مسحوق PEG-diSH في أنبوب microfuge. أضف 70 ميكرولتر من محلول TEA ، ثم دوامة المحلول لمدة 30 ثانية أو حتى يذوب تماما. ضع في اعتبارك تغير الحجم بسبب إذابة المسحوق عن طريق إضافة ما يكفي من محلول TEA (~ 27 ميكرولتر) للوصول إلى حجم محلول نهائي يبلغ 100 ميكرولتر.
      ملاحظة: مسحوق PEG استرطابي للغاية ويجب تخزينه في حاوية مجففة عند -20 درجة مئوية. عند إخراجه من الفريزر ، اترك مسحوق PEG يذوب لمدة 10 دقائق قبل فتح الزجاجة لوزن المسحوق. قم بتطهير الزجاجة بغاز خامل مثل النيتروجين أو الأرجون لإزاحة الهواء الرطب قبل إعادته إلى الفريزر. يمكن تخزين محلول المخزون المكون من 4 أذرع PEG-Ac عند 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى 2 أسابيع قبل الاستخدام. يجب تحضير محلول مخزون PEG-diSH مباشرة قبل الاستخدام ولا يمكن تخزينه لأن مجموعات الثيول تتفاعل مع بعضها البعض لتشكيل روابط ثاني كبريتيد.
  5. تحضير محلول مصفوفة الغشاء القاعدي 2٪ v / v
    1. لتحضير محلول عمل مصفوفة غشاء القاع 2٪ v / v ، أضف 20 ميكرولتر من مصفوفة الغشاء القاعدي (خالية من LDEV) إلى 9.98 مل من الوسائط الكاملة واخلطها جيدا عن طريق السحب لأعلى ولأسفل ~ 10 مرات. تحضير المحلول عند 4 درجات مئوية (على الثلج) ، ثم تسخينه إلى 37 درجة مئوية (في فرن أو حاضنة) واستخدامه على الفور.
      ملاحظة: ستبدأ مصفوفة الغشاء القاعدي في تكوين هلام عند >10 درجة مئوية ، لذا تأكد من خلط محلول مصفوفة الغشاء القاعدي مع الوسائط الكاملة عند 2-6 درجة مئوية. يتم وصف تكوين الوسائط الكامل في الخطوة 1.3.
  6. تحضير محلول مثبت الخلية
    1. لتحضير 1 مل من محلول تثبيت الخلية يحتوي على 4٪ وزن / فولت من بارافورمالدهيد و 0.1٪ v / v من الفاعل بالسطح غير الأيوني ، امزج أولا 891 ميكرولتر من 1x PBS و 108 ميكرولتر من بارافورمالدهيد (تركيز 37٪ وزن / حجم) ، ثم أضف 1 ميكرولتر من الفاعل بالسطح غير الأيوني (تركيز 100٪). خلط الحل جيدا.
      ملاحظة: يجب أن يكون المحلول المثبت طازجا في كل مرة يتم فيها إجراء التثبيت.
      تنبيه: بارافورمالدهيد قابل للاشتعال وقد يشكل تركيزات غبار قابلة للاحتراق في الهواء. يسبب تهيج الجلد وتلف العين الخطير. تجنب التنفس لأنه قد يسبب تهيج الجهاز التنفسي. تعامل مع بارافورمالدهيد في غطاء دخان كيميائي وارتد معدات الحماية الشخصية. اغسل يديك جيدا بعد المناولة. يسبب الفاعل بالسطح غير الأيوني تهيج الجلد وتلفا خطيرا في العين. ارتداء قفازات واقية وحماية العين أو حماية الوجه عند المناولة. لتجنب الإطلاق في البيئة ، افتح الزجاجة في غطاء دخان كيميائي. اغسل يديك جيدا بعد المناولة.
  7. تحضير محاليل التلوين
    1. لتحضير 3 مللي مول من 3،3'-ديهكسيلوكساكاربوسيانين يوديد (DiOC) ، امزج 2.65 مجم من DiOC في 1 مل من DMSO.
    2. لتحضير 1.5 mM من محلول يوديد البروبيديوم (PI) ، امزج 1 مجم من PI في 1 مل من الماء غير المتأين.
  8. تحضير محلول المقاصة الكروية
    1. تحضير محاليل المقاصة بنسبة 20٪ و 40٪ و 80٪ v / v من الفورماميد في 1x PBS لإزالة كروية.
      1. لصنع 10 مل من 20٪ فولت / فولت فورماميد ، امزج 8 مل من 1x PBS متبوعا ب 2 مل من الفورماميد. لصنع 10 مل من الفورماميد v / v 40٪ ، امزج 6 مل من 1x PBS متبوعا ب 4 مل من الفورماميد. لصنع 10 مل من الفورماميد v / v 80٪ ، امزج 2 مل من 1x PBS متبوعا ب 8 مل من الفورماميد.
      2. بعد الجمع بين الفورماميد و 1x PBS ، امزج المحلول عن طريق الدوامة لمدة 30 ثانية تقريبا.

2. تصنيع الآبار الدقيقة الهرمية المربعة

  1. تصنيع قالب PDMS سلبي من الآبار الدقيقة الهرمية المربعة كما هو موضح في الشكل 1.
    1. قم بإعداد 2 جم (~ 1 مل) من محلول سلائف PDMS السلبي واسكبه على بئر واحد من قالب رئيسي هرمي مربع مكون من 6 آبار. لاحظ أن 1 مل يغطي بئرا واحدا بالكامل من اللوحة. بعد تغطية القالب الرئيسي باستخدام PDMS ، قم بإزالة غاز محلول السلائف PDMS لمدة 30 دقيقة عن طريق وضع اللوحة الهرمية المربعة المكونة من 6 آبار في مجفف فراغ. بعد ذلك ، قم بمعالجة PDMS عن طريق وضع الطبق في فرن 60 درجة مئوية لمدة 24 ساعة.
      ملاحظة: تأكد من إزالة غطاء اللوحة للتفريغ ووضعه مرة أخرى للمعالجة. قم بإزالة الغازات من المحلول في مجفف فراغ أو من خلال التطهير بغاز خامل مثل النيتروجين أو الأرجون. إذا كان محلول سلائف العفن السلبي لا يزال يحتوي على فقاعات بعد 30 دقيقة ، مما يشير إلى عدم كفاية التفريغ ، فضعه في مجفف فراغ لمدة 30 دقيقة إضافية. استخدم بئرا واحدا أو عدة آبار في وقت واحد لإعداد واحد أو أكثر من القوالب السلبية PDMS. يمكن استخدام الآبار الدقيقة الهرمية المربعة ذات الأحجام المختلفة ، مثل أطوال الأضلاع 400 و 800 ميكرومتر ، كما هو موضح في الجدول 1. يتم استخدام نفس الكمية من PDMS بغض النظر عن الأحجام الهرمية المربعة.
    2. بمجرد أن يعالج PDMS وهو لا يزال دافئا ، قم بإزالة قالب PDMS السلبي بعناية من القالب الرئيسي باستخدام ملعقة وقطع القالب السلبي في لوح قطره 35 مم باستخدام لكمة خزعة. ضعيها في طبق بتري وقم بتغطيتها بالغطاء واتركيها مستمرة في معالجة RT لمدة 24 ساعة إضافية.
      ملاحظة: لإزالة القوالب السالبة ، استخدم ملعقة للانتقال بين لوحة البئر وقالب PDMS واسحب القالب السالب برفق من القالب الرئيسي. يتم تقطيع القالب إلى ألواح 35 مم لتناسب طبق بتري 35 مم. يمكن صنع القوالب بأحجام أخرى لتناسب الألواح بأقطار مختلفة. يمكن تخزين ألواح القوالب السالبة مقاس 35 مم وحمايتها من الغبار في RT وإعادة استخدامها لمدة 6 أشهر.
  2. تحضير قالب PDMS إيجابي للآبار الدقيقة الهرمية المربعة.
    1. ضع ألواح 35 مم من قالب PDMS السلبي في طبق بتري 35 مم مع توجيه الآبار الدقيقة المحكم لأعلى.
    2. قم بإعداد 2.5 جم (~ 1.2 مل) من محلول سلائف PDMS الإيجابي على النحو الوارد أعلاه واسكبه على القالب السالب في طبق بتري 35 مم لتغطية القالب السلبي بالكامل. ثم قم بإزالة محلول السلائف لمدة 30 دقيقة على النحو الوارد أعلاه وضعه في فرن 60 درجة مئوية لمدة 3-4 ساعات.
      ملاحظة: نظرا لأن PDMS لزج ، يمكن أن تتشكل فقاعة من الهواء المحبوس تحت القالب السالب. إذا تشكلت فقاعة تحت القالب السالب ، ادفع القالب لأسفل برفق باستخدام ملعقة لتحرير الفقاعة. إذا بقيت فقاعات الهواء ، استمر في التفريغ لمدة 30 دقيقة ، أو خذ ملعقة وحرك محلول العفن الإيجابي برفق حتى تنفجر الفقاعات.
    3. بمجرد علاج قالب PDMS الإيجابي ، قم بإزالة القوالب من طبق بتري 35 مم وقشر القالب الإيجابي على الفور من القالب السالب.
      ملاحظة: التوقيت مهم لتقشير القالب الإيجابي بنجاح. من الأفضل إجراء الإزالة عن طريق قطع القالب الموجب قليلا باستخدام ماكينة حلاقة لفضح الواجهة بين القالب الإيجابي والسلبي وتقشير القوالب من بعضها البعض. ثم انزع حواف القالب الدائري. قشر القالب السلبي برفق من القالب الإيجابي.
  3. قم بلصق القوالب في قاع آبار صفيحة 48 بئرا.
    ملاحظة: هنا ، يتم استخدام لوحة 48 بئرا ، ولكن يمكن استخدام ألواح أخرى طالما تم قطع ألواح القالب بأقطار صحيحة (على سبيل المثال ، قطر 6 مم للوحة 96 بئرا).
    1. قطع القوالب الإيجابية إلى ألواح باستخدام لكمة خزعة 10 مم.
      ملاحظة: يمكن قطع ما يقرب من 4 قوالب (قطر كل منها 10 مم) من قالب موجب بقطر 35 مم.
    2. للصق القوالب في قاع صفيحة ذات 48 بئرا ، قم بإعداد محلول سلائف الغراء PDMS (~ 0.5 مل أو 1 جم) كما هو موضح سابقا27. استخدم الملقط لغمس الجانب المسطح برفق (وليس الجانب الذي يحتوي على نمط microwells) من القالب الموجب 10 مم في محلول السلائف PDMS. ضع قالبا واحدا بعناية لكل بئر من صفيحة 48 بئرا ، واضغط برفق على كل قالب في قاع البئر باستخدام الملقط. ضع اللوحة المجمعة في فرن 60 درجة مئوية لمدة 4-24 ساعة للسماح لغراء PDMS بالمعالجة.
      ملاحظة: إذا حصل محلول السلائف الغراء PDMS على الآبار الدقيقة الموجبة للقالب ، فيمكن محوه باستخدام المناديل الورقية الناعمة ، ويمكن تكرار الخطوة. عند الإلتصاق ، تأكد من أن الغراء لا يغطي الآبار الدقيقة.
    3. تعقيم القوالب بإضافة 300 ميكرولتر من الإيثانول بنسبة 70٪ في كل بئر من لوحة 48 بئرا باستخدام ماصة 1000 ميكرولتر. نضح الإيثانول بنسبة 70٪ وضع لوحة 48 بئرا مكشوفة في غطاء زراعة الأنسجة تحت الأشعة فوق البنفسجية (302 نانومتر) لمدة 2 ساعة.
      ملاحظة: يمكن استخدام القوالب لمدة 6 أشهر وإعادة تعقيمها حسب الحاجة.

3. تكوين كروي للورم متعدد الخلايا وحصاده وتغليفه في الهلاميات المائية

ملاحظة: البروتوكول الموضح في هذا القسم مخصص لخط خلايا الورم الأرومي الدبقي البشري U87 (انظر الشكل 1 والشكل 2) ، ولكن يمكن استخدام بروتوكول مماثل مع أنواع الخلايا السرطانية الأخرى.

  1. تشكيل كروي الورم متعدد الخلايا
    1. اغسل قوالب microwell أولا بمحلول شطف مضاد للالتصاق بإضافة 300 ميكرولتر من المحلول إلى كل بئر باستخدام ماصة 1000 ميكرولتر. ثم ، أجهزة الطرد المركزي في 1620 × غرام لمدة 3 دقائق ونضح الحل باستخدام مضخة تفريغ وماصة باستور.
      ملاحظة: قم بتنفيذ هذه الخطوة مباشرة قبل بذر الخلايا.
    2. تعريض الخلايا ل ~ 80 ميكرولتر من 0.25٪ تربسين / EDTA لكل سم2 من منطقة دورق الاستزراع لمدة 5 دقائق عند 37 درجة مئوية. على سبيل المثال ، 1 مل من التربسين / EDTA مناسب لقارورة زراعة الخلايا T-25. تحييد التربسين عن طريق إضافة نفس الحجم من وسط زراعة الخلايا الكامل. على سبيل المثال ، أضف 1 مل من الوسط الكامل إلى دورق زراعة الخلايا T-25 المحتوي على التربسين. جمع الخلايا من قارورة زراعة الأنسجة.
    3. نقل 10 ميكرولتر من تعليق الخلية إلى كل منفذ من مقياس الدم لعد الخلايا. استخدم مجهرا مقلوبا لحساب العدد الإجمالي للخلايا ومتوسط عدد الخلايا من 8 أرباع على الأقل ، مما يضمن أن عدد الخلايا في كل ربع من مقياس الدم هو 20-50 للحصول على نتائج جيدة لعدد الخلايا. اضرب الرقم المحسوب في 104 لتحديد تركيز الخلية النهائي.
    4. أعد تعليق الخلايا المجمعة في وسط زراعة خلايا RPMI الكامل المكمل بمصل بقري جنيني بنسبة 10٪ و 1٪ بنسلين / ستربتومايسين بتركيز الخلية النهائي المطلوب ، اعتمادا على حجم الكروي المطلوب ، كما هو موضح في الجدول 1.
      ملاحظة: ستنتج الآبار الدقيقة 800 ميكرومتر ~ 75 كروية في بئر واحدة من صفيحة 48 بئرا ، وستنتج الآبار الدقيقة 400 ميكرومتر ~ 300 كروية في بئر واحد من صفيحة 48 بئرا.
    5. ضع 500 ميكرولتر من معلق الخلية عند التركيز المطلوب في الآبار الدقيقة وطرد مركزي اللوحة عند 1620 × جم لمدة 3 دقائق. ضع اللوحة في حاضنة مرطبة عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO2 لمدة 24 ساعة للسماح بتكوين كرويات.
      ملاحظة: إذا لم تتشكل كرويات ، يمكن استخدام 2٪ v / v من مصفوفة الغشاء القاعدي جنبا إلى جنب مع الوسائط الكاملة لإعادة تعليق الخلايا (مزيد من التفاصيل في الخطوة 1.5).
  2. حصاد كرويات
    1. باستخدام ماصة 1000 ميكرولتر ، ماصة بقوة 500 ميكرولتر من الوسط الكامل في البئر. باستخدام 500 ميكرولتر من الوسط من البئر ، اغسل الأرباع الأربعة للبئر (على وجه التحديد الأرباع العلوية والسفلية واليسرى واليمنى) عن طريق السحب لأعلى ولأسفل في الأرباع ثلاث إلى أربع مرات لإزاحة الأجسام الكروية. قم بشفط الوسط الذي يحتوي على الأجسام الكروية برفق (~ إجمالي 1000 ميكرولتر) في أنبوب طرد مركزي دقيق باستخدام ماصة 1000 ميكرولتر واترك الكرويات تستقر في القاع.
    2. قم بإزالة المادة الطافية وأعد تعليق الكائنات الكروية إلى التركيز النهائي المطلوب. على سبيل المثال ، لتحقيق ~ 8 كرويات في هلام 20 ميكرولتر بعد التغليف ، أعد تعليق الكرات في 100 ميكرولتر من الوسائط ، مما ينتج عنه تركيز كروي ~ 75 كروي / 100 ميكرولتر في التعليق الكروي.
  3. تغليف كرويات في الهلاميات المائية، كما هو موضح في الشكل 2.
    1. لإنشاء 100 ميكرولتر من محلول سلائف هيدروجيل PEG بنسبة 10٪ وزن / وزن ، اجمع بين 50 ميكرولتر من التعليق الكروي ، متبوعا ب 30 ميكرولتر من 20٪ وزن / وزن 4 أذرع PEG-Ac وأخيرا 20 ميكرولتر من 20٪ وزن / وزن PEG-diSH في أنبوب طرد مركزي دقيق. سيعطي هذا نسبة مولار عشوائية من مجموعات الأكريليت (Ac) إلى مجموعات الثيول (SH) لضمان التشابك الأمثل. امزج محلول سلائف الهلام عن طريق السحب لأعلى ولأسفل ~ 10 مرات.
      ملاحظة: يمكن تغيير تركيبة الهيدروجيل وحجمه وتناغم البوليمر حسب الحاجة. سوف تكون الهلاميات المائية الناتجة تتحلل ببطء ولاصقة غير خلوية. لجعل خلية هيدروجيل لاصقة ، يمكن إضافة ليجند لاصق مثل RGDS. لجعل الهيدروجيل قابلا للتحلل إنزيميا ، يمكن إضافة رابط متشابك ببتيد قابل للتحلل إنزيميا يحتوي على بقايا السيستين على كلا الطرفين. عند نقل الكرات ، قم بسحب المحلول برفق مرتين لإزاحة الأجسام الكروية وتعليقها لضمان التوزيع المتساوي للكرويات.
    2. ماصة 20 ميكرولتر من محلول السلائف الهلامية بين شريحتين زجاجيتين مبطنة بغشاء مظلي مفصولة بفواصل سيليكون 1 مم ، ووضع الشرائح بمحلول سلائف الهلام في 37 درجة مئوية ، حاضنة CO2 5٪ لمدة 15 دقيقة للسماح بالهلام.
      ملاحظة: تأكد من تغطية الشريحتين الزجاجيتين ببارافيلم لإنشاء سطح كاره للماء مما يسمح بالتقشير بسهولة عند الهلام. بدلا من parafilm ، يمكن استخدام محلول طلاء مسعور. سيؤدي حجم 20 ميكرولتر من محلول سلائف الهيدروجيل إلى لوح هيدروجيل قطره ~ 6 مم وارتفاعه 1 مم قبل التورم. يمكن استخدام أي نوع وسمك فاصل ، ولكن يوصى بالحفاظ على سمك الهلام عند أو أقل من 1 مم (يمكن أن تحد الهلاميات المائية السميكة من انتشار الأكسجين ونقل العناصر الغذائية إلى الخلايا) ولكن أكبر من قطر الكرة (بحيث يتم تغليف الكرويات بالكامل في الجل). يمكن استخدام أي حجم من محلول سلائف هيدروجيل. المواد الهلامية 20-30 ميكرولتر مناسبة للوحة 24 بئر.
    3. بمجرد اكتمال هلام الهيدروجيل ، افصل الشريحتين الزجاجيتين وقشر المواد الهلامية برفق من اللوحة الزجاجية باستخدام ملعقة. ضع المواد الهلامية في طبق من 24 بئرا ، واحد لكل بئر ، مع التأكد من أن السطح الذي يحتوي على الأجسام الكروية مواجه لأعلى.
      ملاحظة: سوف تسقط الأجسام الكروية في قاع الجل أثناء الهلام ، لذا فإن قلبها للزراعة سيضمن وجود الأجسام الكروية بالقرب من سطح الهيدروجيل لتحسين الوصول إلى العناصر الغذائية والأكسجين. يمكن مراقبة الهلام من خلال مراقبة أي محلول سلائف هيدروجيل متبقي في أنبوب الطرد المركزي الدقيق ولا يستخدم لإنشاء ألواح عن طريق قلب الأنبوب وملاحظة الوقت الذي يتوقف فيه الجل عن التدفق.
    4. أضف وسطا كاملا (~ 500 ميكرولتر) إلى كل بئر وتأكد من غمر الهيدروجيل بالكامل. ضع الصفيحة متعددة الآبار في حاضنة مرطبة عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO2 واستزرع الخلايا ذات التغيرات المتوسطة كل 2-3 أيام.
      ملاحظة: يمكن استزراع الهلاميات المائية لمدة تصل إلى 4 أسابيع أو حتى تتحلل الهلاميات المائية ، وتغيير الوسائط كل يوم.

4. تلطيخ الفلورسنت

  1. صلاحية الخلية
    1. استخدم يوديد 3،3'-dihexyloxacarbocyanine (DiOC) ، الذي يلطخ الميتوكوندريا والشبكة الإندوبلازمية لجميع الخلايا ، لتحديد صلاحية الخلية. استخدم DiOC (3 mM) بتركيز 0.02 ميكروغرام / مل. على وجه التحديد ، استخدم ماصة 20 ميكرولتر لإضافة 2 ميكرولتر من DiOC لكل 1000 ميكرولتر من الوسائط في القارورة التي تزرع الخلايا المنفصلة (على الأقل 24 ساعة قبل عملية تكوين الأجسام الكروية في القسم 3). اترك 24 ساعة حتى يلطخ DiOC الخلايا.
    2. استخدم الصبغة النووية والكروموسومية ، يوديد البروبيديوم ، PI (1.50 mM) ، الذي يدخل الخلايا الميتة فقط. لتلطيخ الخلايا ، قم أولا بشفط جميع الوسائط وشطف الجل باستخدام ماصة 1000 ميكرولتر لإضافة 500 ميكرولتر من 1x PBS حتى يتم غمر الجل بالكامل.
    3. نضح PBS وأضف 500 ميكرولتر من الوسائط الجديدة ، متبوعا ب 30 ميكرولتر من محلول PI لكل بئر (أي 6 ميكرولتر لكل 100 ميكرولتر من الوسائط). قم بتغطية لوحة البئر بورق الألمنيوم لحمايتها من الضوء. ضع صفيحة البئر في حاضنة عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO2 واترك 30 دقيقة حتى يقوم PI بتلطيخ الخلايا الميتة.
    4. قم بإزالة الرقاقة واستنشاق الوسائط من الآبار. استخدم ماصة 1000 ميكرولتر لإضافة 500 ميكرولتر من 1x PBS لغمر الهيدروجيل. نضح 1x PBS وكرر الشطف مرتين إضافيتين. أضف 500 ميكرولتر من الوسائط إلى كل بئر وصورة تحت مجهر فلوري مقلوب أو متحد البؤر.
    5. احسب صلاحية الخلية من خلال مقارنة مساحة DiOC (جميع الخلايا) ب PI (الخلايا الميتة) ، كما هو موضح في المعادلة 1 ، باستخدام صور z-stack من مجهر متحد البؤر أو مجهر فلوري مقلوب.
      Equation 1 مكافئ 1.

5. تثبيت التألق المناعي ، تلطيخ ، إزالة ، وتصوير كرويات مغلفة

  1. التثبيت والتلوين
    1. قم بشفط الوسائط من الآبار حيث يتم استزراع الهلاميات المائية ، واشطف الهلاميات المائية عن طريق سحب 500 ميكرولتر من 1x PBS مباشرة على الهلاميات المائية. نضح بلطف 1x PBS.
    2. ثبت الكرات في لوحة 24 بئرا باستخدام ماصة 1000 ميكرولتر لإضافة حجم 500 ميكرولتر من المحلول المثبت لكل بئر. اترك المثبت ينقع المواد الهلامية لمدة 30 دقيقة في RT. قم بإزالة المحلول المثبت باستخدام ماصة سعة 1000 ميكرولتر وتخلص منها في حاوية نفايات مخصصة.
    3. شطف الهلاميات المائية عن طريق إضافة 500 ميكرولتر من 1x PBS إلى كل بئر. نضح 1x PBS باستخدام ماصة 1000 ميكرولتر وكرر شطف PBS مرتين إضافيتين. قم بتخزين لوحة البئر في 500 ميكرولتر من 1x PBS لكل بئر عند 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى أسبوع واحد أو استخدمها على الفور.
      ملاحظة: احرص على عدم سحب الهلاميات المائية إلى الماصة عند شفط PBS والمحلول المثبت. افعل ذلك عن طريق قلب اللوحة بزاوية ~ 45 درجة ، مما سيساعد في رؤية الهلاميات المائية ومنع الشفط العرضي.
      تنبيه: الفورمالديهايد سام عند الاستنشاق والاتصال. تعامل مع القفازات في غطاء دخان كيميائي.
    4. لتلطيخ الخلايا ، احتضان الكرات المغلفة بالهيدروجيل مع الأجسام المضادة الأولية ل Nestin (200 ميكروغرام / مل) و SOX2 (200 ميكروغرام / مل) بتخفيف 1: 200 من الجسم المضاد: PBS. استخدم ماصة 1000 ميكرولتر لشفط 1x PBS من الآبار. أضف 50 ميكرولتر من الجسم المضاد المخفف إلى كل بئر. اترك 24 ساعة حتى يكتمل التلطيخ. بعد ذلك ، قم بإزالة محلول التلوين باستخدام ماصة 1000 ميكرولتر وتخلص من النفايات بشكل مناسب.
    5. استخدم ماصة 1000 ميكرولتر لإضافة 500 ميكرولتر من 1xPBS ، وهو ما يكفي لغمر الهيدروجيل. نضح برنامج تلفزيوني وكرره مرتين أخريين. قم بتخزين الهيدروجيل الملون والمغمور في 1x PBS عند 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى أسبوعين قبل التصوير أو الصورة على الفور.
      ملاحظة: قد تكون هناك حاجة إلى تحسينات طفيفة اعتمادا على الجسم المضاد لضمان تلطيخ مناسب. التركيز (1: 200) والوقت (24 ساعة) أعلى بكثير مما هو عليه في ثقافة الخلايا أحادية الطبقة 2D النموذجية لأن تلطيخ 3D يتطلب الانتشار من خلال الهيدروجيل والكرويات.
  2. بعد تلطيخ الكرويات ، قم بمسح الكروي لتحسين الشفافية للتصوير عن طريق استبدال PBS بزيادة تركيز متسلسلة من الفورماميد (اختياري).
    1. نضح 1x PBS من كل بئر. أضف 500 ميكرولتر من الفورماميد 20٪ (v / v) إلى كل بئر واترك الهيدروجيل يحتضن لمدة 90 دقيقة. نضح الفورماميد باستخدام ماصة 1000 ميكرولتر وجمع النفايات في حاوية نفايات.
    2. أضف 500 ميكرولتر من الفورماميد 40٪ (v / v) إلى البئر. اسمح للهيدروجيل بالاحتضان في المحلول لمدة 90 دقيقة. نضح الفورماميد وجمع النفايات في حاوية النفايات.
    3. أضف 500 ميكرولتر من الفورماميد 80٪ v / v إلى كل بئر واحتضانها لمدة 90 دقيقة. نضح الفورماميد والتخلص منه في حاوية النفايات. أضف 500 ميكرولتر من 100٪ (v / v) من الفورماميد واترك الحضانة لمدة 24 ساعة قبل التصوير. عند الانتهاء من الإزالة ، تخلص بشكل صحيح من نفايات الفورماميد من خلال الخدمات المناسبة لنظام إدارة نفايات المختبر.
      ملاحظة: يسمح التطهير بالتصوير متحد البؤر في قلب الكرة وهو اختياري إذا تم فحص محيط الكرة الأرضية فقط.
  3. تصوير كرويات مغلفة بهيدروجيل باستخدام المجهر متحد البؤر.
    ملاحظة: يمكن استخدام أي مجهر - مقلوب أو فلوري أو متحد البؤر - لتصوير الخلايا. ومع ذلك ، يسمح Confocal بعزل الطائرات المفردة.
    1. ضع الهلاميات المائية في آبار حجرة ذات قيعان زجاجية وضع الأجسام الكروية بالقرب من غطاء الغطاء قدر الإمكان.
      ملاحظة: يمكن استخدام أغطية زجاجية أو آبار حجرية ذات قيعان زجاجية منزلقة. من الأهمية بمكان الحفاظ على رطوبة الهلاميات المائية لأن العينات المجففة ستؤدي إلى جودة تصوير رديئة.
    2. قم بتصوير العينات بهدف مسافة العمل الطويلة (10x-20x) للسماح بالتصوير في عمق الكرة باستخدام Z-stacks لإعادة البناء ثلاثية الأبعاد.
      ملاحظة: تسمح أهداف التكبير الأعلى بتصوير أكثر تفصيلا وتقسيما بصريا ولكنها تضحي بعمق الصورة.
    3. حدد كمية الإشارة الموجودة في القسم البصري بالنسبة إلى المساحة الكلية للكروية لكل من الإشارة التي تم مسحها وغير المسحة باستخدام المعادلة 2.
      Equation 2 مكافئ 2

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

يتم البحث بشكل متزايد عن منصات فحص الأدوية القائمة على الكروية لدراسة تأثيرات العلاج الكيميائي بسبب التركيز على تعديل البيئة المكروية للورم عند تغليف كروي في المواد الحيوية التي تكرر الأنسجة الأصلية. هنا قمنا بتطوير طريقة لإعداد كروية الورم متعدد الخلايا والتغليف اللاحق والتصوير في هيدروجيل 3D. يتم تحضير الكرات في قوالب microwell (الشكل 3A ، B) ، مما ينتج عنه كرويات ذات أشكال كروية وتعدد تشتت يتم التحكم فيه بإحكام. على سبيل المثال ، بالنسبة للكرويات التي تحتوي على 3300 خلية لكل ميكروويل ، كان متوسط حجم الكرة ~ 250 ميكرومتر ، وكانت الدائرية >0.8 ، حيث 1 هي كرة مثالية (الشكل 3C ، D). بلغت نسبة معامل التباين (٪ CV) لقطر الكرة 19.3٪ ، و ٪ CV للدائرية 4.5٪. كانت أقطار كروية تعتمد على عدد الخلايا لكل ميكروويل ، كما هو موضح في الجدول 1. لاحظ أن بعض الخلايا في الآبار الدقيقة قد لا يتم دمجها في الكروي وسيتم غسلها أثناء خطوة حصاد الكرة الأرضية.

يمكن تصوير الكروي على أعماق مختلفة من Z-stack ، مما يسمح بصلاحية الخلية لكل موقع داخل Z-stack (الشكل 4). لاحظ أنه نظرا لقيود التصوير متحد البؤر وكثافة الخلايا العالية ، لا يمكن تصوير النواة الكروية بالكامل. كما تمت مناقشته لاحقا ، قد تكون هناك حاجة إلى إزالة كروية أو تقسيمها لتحسين التصوير في جميع أنحاء الكروية. من خلال هذه الطريقة ، تم تحديد صلاحية الكرة لتكون عالية (~ 90٪) مباشرة بعد الحصاد والتغليف ، على الرغم من أن صلاحية الخلية انخفضت قليلا إلى 85٪ في قلب الكرة مقارنة بالمحيط. لضمان البقاء في جميع أنحاء كروية ، تم فصل كرويات باستخدام acutase ، وتم حساب صلاحية الخلايا المنفصلة باستخدام نفس الطريقة ووجد أنها عالية بنفس القدر (>90٪). يمثل الإسقاط الأقصى باستخدام المكدس الكروي أعلى نقطة من شدة الضوء داخل كل موقع من مكدس Z المضغوط في صورة واحدة (الشكل 4B).

يتم عرض صور تمثيلية للكرويات العائمة الحرة (بدون هلام) والكرويات المغلفة (هلام PEG) الملطخة بعلامات الجذعية Nestin و SOX2 في الشكل 5. Nestin هو خيوط وسيطة وعلامة الخلايا الجذعية الموجودة في الأورام الدبقية. SOX2 هو عامل نسخ للتجديد الذاتي ، موجود أيضا في الأورام الدبقية. تم العثور على SOX2 ليكون موضعيا مع DAPI في النواة ، بينما كان Nestin موجودا في جميع أنحاء الخلايا. لا تظهر البيانات أي فرق بين الجل وعدم وجود ظروف هلام ، ربما بسبب أن هلام PEG المستخدم هنا خامل ولا يسهل تفاعلات مصفوفة الخلية من خلال إشارات integrin.

أحد القيود الرئيسية للتصوير هو الكثافة الكروية العالية ، مما يجعل من الصعب التصوير في قلب الكرة الأرضية. تتضمن الطرق الشائعة لتصوير النواة الكروية تقسيم الأقسام ومسحها. يمكن أن يعمل هذا بشكل جيد مع الأجسام الكروية العائمة الحرة ، لكن تقسيم الهلاميات المائية أمر صعب ، ومعظم إزالة الأنسجة تتضمن تجفيف العينات ، مما يؤدي إلى عينات مشوهة. هنا قمنا بتكييف بروتوكول من Kuwajima et al.28 لعينات هيدروجيل للحفاظ على بنية كروية مع الاستمرار في إزالة الأجسام الكروية. لإثبات فائدة طريقة المقاصة ، تم تثبيت الكرات الكروية وتلطيخها ب PI وتطهيرها (الشكل 6). يوضح الشكل 6A صورا تمثيلية للمقاطع البصرية عند ~ 90 ميكرومتر إلى كرويات تم تطهيرها وغير المسحوبة والمساحة الإجمالية للكروية عند ملء المنطقة الكروية. عندما تم إجراء المقاصة ، يمكن تصوير النواة الكروية ~ 30 ميكرومتر أعمق ، مقارنة بكروي غير واضح (الشكل 6 ب). يمكن أن تكون المقاصة مفيدة جدا للتألق المناعي ، حيث يمكن تحليل التنظيم المكاني للمؤشرات الحيوية في قلب الأجسام الكروية. لا يمكن استخدام هذه الطريقة إلا للعينات الثابتة حيث يتم تعطيل سلامة الغشاء.

Figure 1
الشكل 1: تصنيع قالب PDMS وتشكيل كروي. تضاف حلول سلائف PDMS إلى ألواح microwell الهرمية المربعة لتشكيل قوالب PDMS. يضاف تعليق الخلية المنفصل إلى قوالب PMDS المشكلة ويتم تدويره لأسفل للسماح بتكوين كروي بعد 24 ساعة. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

Figure 2
الشكل 2: تغليف الهيدروجيل وزراعته وتصويره. (أ) يتم دمج 4 أذرع PEG-Ac و PEG diSH والتعليق الكروي في أنبوب طرد مركزي دقيق و (B) يخلط جيدا عن طريق السحب لأعلى ولأسفل لتشكيل محلول سلائف هلامية. (ج) يوضع 20 ميكرولتر من محلول السلائف الهلامية على شريحة زجاجية، وتوضع شريحة زجاجية ثانية فوق المحلول وتفصل بينها فواصل 1 مم. (د) ينقل الهيدروجيل إلى 24 صفيحة بئر مع توجيه كروي لأعلى ومغطى بوسائط (500 ميكرولتر). (ه) ينقل الهيدروجيل إلى غطاء زجاجي للتصوير المجهري. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 3
الشكل 3: تكون كروي في الآبار الدقيقة قبل الحصاد، بعد 24 ساعة من البذر الأولي للخلايا في الآبار الدقيقة. (أ) كرويات في ميكروويل ملطخة ب DiOC (أخضر). شريط المقياس هو 200 ميكرومتر. (ب) صورة برايتفيلد للكرويات في الآبار الدقيقة. ج: الرسم البياني لقطر الكرة في الآبار الدقيقة. د: الرسم البياني للدائرية الكروية في الآبار الدقيقة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 4
الشكل 4: صورة تمثيلية متحدة البؤر على شكل Z لكروية حية لتحليل الموتى الأحياء. (أ) صور من 4 شرائح من مكدس Z مع DiOC (أخضر) و PI (أحمر). شريط المقياس هو 200 ميكرومتر. (B) أقصى إسقاط ل Z-Stack. ج: صلاحية الخلية كدالة للعمق الكروي. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 5
الشكل 5: تلطيخ Nestin و SOX2 المناعي للكرويات الخلوية U87 العائمة الحرة (بدون هلام) والمغلفة بالهيدروجيل (PEG gel) في اليوم 5 من الثقافة. تؤكد الصور التمثيلية متحدة البؤر للكرويات تعبير Nestin (الأحمر) و SOX2 (الأخضر) ، والتي تم تلوينها ب DAPI (أزرق ؛ نواة). شريط المقياس هو 100 ميكرومتر. تظهر الصور التي تم اقتصاصها وتكبيرها من المربع الأبيض العلاقة بين النواة (الأزرق) و SOX2 (الأخضر). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 6
الشكل 6: عمق تصوير الأجسام الكروية التي تم تطهيرها. (أ) صور كروية مصورة على بعد 91.6 ميكرومتر في المنطقة الكروية والمساحة الكروية الكلية. (ب) النسبة المئوية للمساحة الكروية المصورة مع زيادة العمق في الكرة الأرضية. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

حجم ميكروويل (ميكرومتر) عدد الخلايا لكل كروية عدد الخلايا لكل بئر تركيز الخلية (الخلايا / مل) قطر كروي (ميكرومتر)
400 200 120000 240000 115.4 ± 13.5
500 300000 600000 144.6 ± 14.3
1000 600000 1200000 176.5 ± 12.5
800 2000 300000 600000 212.4 ± 15.7
3000 450000 900000 258.9 ± 16.3
4000 600000 1200000 305.7 ± 21.6
5000 750000 1500000 323.4 ± 29.8

الجدول 1: قطر سبيرويد وحجم ميكروويل. العدد المحسوب للخلايا لكل كروي ، وعدد الخلايا لكل بئر من صفيحة 48 بئرا ، وتركيز الخلية ، وقطر كروي ناتج اعتمادا على حجم البئر الصغير لقالب PDMS السلبي.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

يتم تطوير نماذج كروية للورم متعدد الخلايا القائمة على الهيدروجيل بشكل متزايد لتعزيز الاكتشافات العلاجية للسرطان11،13،29. إنها مفيدة لأنها تحاكي المعلمات الرئيسية للبيئة المكروية للورم بطريقة خاضعة للرقابة ، وعلى الرغم من تعقيدها ، فهي أبسط وأرخص في الاستخدام من النماذج في الجسم الحي ، والعديد منها متوافق مع تقنيات الفحص عالية الإنتاجية. يمكن ضبط المواد الحيوية الهيدروجيل لمحاكاة مصفوفة الورم خارج الخلية وتسهيل تفاعلات مصفوفة الخلية ، ويحاكي الكروي (على عكس الخلايا المنفصلة) تفاعلات الخلايا الخلوية للورم الأصلي. الهلاميات المائية الاصطناعية ، كما هو موضح هنا ، مفيدة بشكل خاص لأن الهيدروجيل يوفر الدعم الهيكلي المطلوب والخصائص الفيزيائية والميكانيكية ، في حين يمكن استخدام الروابط اللاصقة أو التسلسلات القابلة للتحلل لضبط خصائص المواد الكيميائية الحيوية بشكل مستقل. توفر الهلاميات المائية الاصطناعية أيضا تباينا أقل من دفعة إلى أخرى ونطاقات أكبر من خصائص المواد ، بما في ذلك معظم الأنسجة الرخوة في الجسم.

هنا ، نصف بالتفصيل استخدام هيدروجيل خامل قائم على PEG يتشكل عبر إضافة من نوع مايكل كما هو موضح سابقا25,30. يحتوي هيدروجيل PEG التمثيلي المستخدم هنا على معامل يونغ ~ 8 كيلو باسكال ، على غرار تصلب أنسجة الورم الأرومي الدبقي9. يعتبر هيدروجيل PEG مناسبا لأنه يحتوي على خصائص قابلة للضبط وكيمياء جيلية محددة للغاية ويمكن تشكيله في وجود كرويات دون المساس بصلاحية الخلية (الشكل 4). في حين أن هيدروجيل PEG خامل ويعمل كسقالات خلوية ذات خصائص فيزيائية وميكانيكية محددة ، يمكن إضافة روابط لاصقة للخلايا لتوجيه تفاعلات مصفوفة الخلية ، ويمكن إضافة روابط متشابكة ببتيد قابلة للتحلل إنزيميا للمساعدة في إعادة تشكيل المصفوفة9. يمكن اختيار الروابط اللاصقة والروابط المتشابكة الببتيد لمحاكاة البيئة المكروية الخلوية لإضافة أهمية فسيولوجية أو مرضية للنموذج. لمزيد من التفاصيل حول تعديلات هيدروجيل PEG لضبط قابلية تحلل الهيدروجيل ، والخصائص الميكانيكية ، والالتصاق ، تتم إحالة القراء إلى العمل المنشور التالي9،27.

باستخدام الطريقة الموضحة هنا ، يمكن تشكيل كميات كبيرة من الأجسام الكروية السرطانية بسرعة وتغليفها في هيدروجيل PEG لاستكشاف تأثير خصائص الركيزة على صلاحية الخلايا الكروية أو التشكل أو جذع الخلية (الشكل 4 والشكل 5) ، من بين خصائص أخرى. يسمح للخلايا أولا بالتجمع وتكوين كروية ثم تغلف في الهلاميات المائية ، كما هو موضح في الشكل 2 والشكل 3. تتيح عملية التجميع تغيير أحجام الكروية بناء على حجم قوالب الميكروويل وتركيز تعليق الخلية الماصة في قوالب الميكروويل (الجدول 1). الكرويات الناتجة أحادية نسبيا في الحجم ، بمتوسط معامل تباين ~ 10٪ -20٪ لجميع الظروف. هذا مفيد لمجموعة متنوعة من التطبيقات ، حيث ستظهر الأحجام المتشابهة قيودا مماثلة على الانتشار ، سواء كان ذلك من الأدوية أو المغذيات أو الأكسجين ، في الكروي. تحتوي الأجسام الكروية أيضا على دائرية تبلغ >0.8 ، وهو ما يمكن مقارنته بطرق أخرى منخفضة للغاية أو طرق إسقاط معلقة31. لاحظ أنه يمكن استخدام طرق أخرى لتشكيل كروي أولا ، مثل طريقة القطرة المعلقة أو نظام زراعة الخلايا الدوارة32 ، ثم تغليفها في الهيدروجيل. ومع ذلك ، فإن الطريقة الموضحة هنا لا تتطلب أي معدات متخصصة أو مواد استهلاكية باهظة الثمن ، وبالتالي ، تساعد في إمكانية الوصول لجميع المختبرات.

بينما تستخدم الطرق الموضحة هنا خط خلايا الورم الأرومي الدبقي U87-MG ، يمكن استخدام طريقة التصنيع والتغليف الكروية الموصوفة لأنواع مختلفة من الخلايا السرطانية التي تشكل أوراما صلبة. إذا لم تتجمع الخلايا بسهولة لتشكيل كروي ، فيمكن إضافة خليط من بروتينات ECM ، مثل مصفوفة الغشاء القاعدي ، إلى تعليق الخلية للمساعدة في العملية (كما هو موضح في الطرق). بمجرد تغليف الكرات ، من الأفضل أن يتم تصويرها وتحليلها مباشرة في الهيدروجيل بدلا من استخلاصها من الهيدروجيل أو الخلايا التي يتم فصلها. وذلك لأن الأجسام الكروية عادة ما تكون غير متجانسة (على سبيل المثال ، يمكن أن يتشكل قلب نقص الأكسجين بسبب تدرجات الأكسجين والمغذيات) ، وستختلف استجابات الخلايا بناء على الموضع داخل الكروي. أيضا ، قد يحجب استخراج الخلايا دور تفاعلات مصفوفة الخلية على مصير كروي. على سبيل المثال ، أظهرنا سابقا أن الخلايا الموجودة في المحيط الكروي مقابل القلب لها استجابة مختلفة للعلاج الكيميائي ، والتي تعتمد بشكل أكبر على الخواص الميكانيكية للركيزة27. ومن ثم ، نوصي باستخدام تقنيات الفحص المجهري لدراسة السلوكيات الكروية ، كما هو موضح في هذه المخطوطة.

إحدى القضايا التي يجب مراعاتها عند تصوير الأنسجة الكثيفة مثل الأجسام الكروية هي عتامتها. هنا نصف طريقة المقاصة لتحسين إمكانية التصوير من خلال الجزء الداخلي من الكرة (الشكل 6). ومع ذلك ، على الرغم من أن إزالة الكرة الأرضية تساعد في زيادة عمق التصوير إلى أقصى حد ، يمكن العثور على قيود عند وضع الأجسام الكروية المغلفة في الفورماميد مما يؤدي إلى تلف هيكلي محتمل ويؤثر على قابلية التصوير الكروي. لا يمكن إجراء هذه العملية أيضا عند مراقبة صلاحية الخلية من خلال التلوين الحي / الميت لأن التطهير يتطلب التثبيت. تتطلب عملية المقاصة أيضا عدة ساعات من الحضانة في الفورماميد بعد تلطيخها ، لذلك يمكن أن تؤثر على الأصباغ المستخدمة. يمكن أن تعمل أيضا تقنيات أخرى ، مثل التقسيم بالتبريد ثم التلوين المناعي ، بشرط ألا يؤدي التقسيم إلى تشويه أو المساس بسلامة الأنسجة الكروية. في أيدينا ، أدى التشريح بالتبريد إلى كرويات "مطحونة" بسبب نعومة الهيدروجيل ، والتي تبلغ ~ 8 كيلو باسكال في معامل يونغ ، لمحاكاة تصلب أنسجة الورم الأرومي الدبقي.

بشكل عام ، تتمثل الخطوات الحاسمة في هذا البروتوكول في التصنيع الكروي الناجح ، وتغليف الهيدروجيل وثقافته ، والتصوير والتحليل الكروي. ومن ثم ، فقد قدمنا ملاحظات واستراتيجيات استكشاف الأخطاء وإصلاحها لتلك الخطوات. يمكن استخدام الكرات الكروية المغلفة بالهيدروجيل الموصوفة هنا في مجموعة متنوعة من التطبيقات ، مثل منصات فحص الأدوية ، والدراسات التفصيلية لتفاعلات مصفوفة الخلية وتأثيرها على سلوكيات الخلية ، ودراسات مسببات الأمراض ، إلخ. يمكن مساعدة مثل هذه الدراسات من خلال ضبط النظام الموصوف كما تمت مناقشته أعلاه والخصائص التي يمكن التنبؤ بها والتحكم فيها لهيدروجيل PEG الاصطناعي. تتضمن بعض قيود النظام الموصوف إنتاجية متوسطة ، حيث يفضل الإنتاجية العالية للدراسات متعددة الإرسال أو الدراسات ذات الحجم الكبير مثل فحص الأدوية. هناك قيد آخر وهو الحاجة إلى التصوير ، مثل التصوير متحد البؤر ، لتحليل البيانات. بينما يسمح التصوير بتحليل خاص وزمني مفصل ، إلا أنه يستغرق وقتا طويلا ويعوقه قيود الاختراق بسبب العمق وكثافة الخلايا الكروية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

Acknowledgments

تم تمويل هذا العمل من خلال أموال البدء المقدمة للدكتورة سيلفيا بي زوستياك من جامعة سانت لويس وكذلك من خلال منحة أولية من مركز هنري وأميليا نصر الله لعلم الأعصاب في جامعة سانت لويس منحت للدكتورة سيلفيا بي زوستياك.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
70% Ethanol Fisher Scientific  LC22210-4
15 mL Conicals FALCON 352097
24-Well Plate Ultra Low Attachment plates Fisher Scientific 07-200-602
35 mm Petri Dish Amazon 706011
4-arm poly(ethylene glycol)-acrylate (4-arm PEG-Ac; 10 kDa) Laysan Bio ACRL-PEG-ACRL-10K-5g
50 mL Conicals Fisher Scinetific 3181345107
6-well AggreWell 400  StemCell Technologies, Vancouver, Canada 34421 Square pyramidal microwells 
anti-adherence rinsing solution StemCell Technologies, Vancouver, Canada Cat #: 07010
Aspartic Acid-Arginine-Cysteine-Glycine-Valine-Proline-Methionine-Serine-Methionine-Arginine-Glycine-Cysteine-Arginine- Aspartic Acid (DRCG-VPMSMR-GCRD) peptide Genic Bio, Shanghai, China n/a Custom synthesis
Chemical Fume Hood KEWAUNEE 99151
Corning Matrigel Basement Membrane Matrix, LDEV Free  Corning 356234 Basement membrane matrix
Detergent - Triton-X Sigma Aldrich T8787 Nonionic surfactant
Dimethyl sulfoxide (DMSO) Fisher Scientific  BP231-100
Disposable Pipettes (1 mL, 2 mL, 5 mL, 10 mL, 25 mL, 50 mL) Fisher Scinetific 1 mL: 13-678-11B, 2mL: 05214038, 5mL(FALCON): 357529, 10mL: 13-678-11E, 25mL: 13-678-11, 50mL: 13-678-11F
Fetal Bovine Serum HyClone SH30073-03
Formaldehyde 37% Solution Sigma Aldrich F1635
Glass Plates Slumpys GBS4100SFSL
Glass Transfer Pipettes Fisher Scinetific 5 3/4": 1367820A, 9":136786B
Glycine-Arginine-Cysteine-Aspartic Acid-Arginine-Glycine-Aspartic Acid-Serine (GRCD-RGDS) peptide Genic Bio, Shanghai, China n/a Custom synthesis
Hemacytometer Bright-Line 383684
Hydrophobic solution - Repel Silane  GE Healthcare Bio-Sciences 17-1332-01
Incubator NUAIRE NU-8500
Inverted Microscope (Axiovert 25) Zeiss 663526
Invitrogen DiOC16(3) (3,3'-Dihexadecyloxacarbocyanine Perchlorate) Fisher Scientific  D1125
Leica Confocal SP8 Leica Microsystems Inc.
Light and Flourescent Microscope (Axiovert 200M) Zeiss 3820005619
Micro centrifuge tubes Fisher Scientific 2 mL: 02681258
Microscope Software Zeiss AxioVision Rel. 4.8.2
Nestin Alexa Fluor 594  Santa Cruz Biotechnology sc-23927
Parafilm PARAFILM  PM992
PBS (1x), pH 7.4 HyClone SH30256.01
Penicillin Streptomycin MP Biomedicals 1670046
Pipette Aid Drummond Scientific Co. P-76864
Pipette Tips (1–200 µL, 101–1000 µL) Fisher Scinetific 2707509
Plastic Standard Disposable Transfer Pipettes Fisher Scientific 13-711-9D
Plastic Weigh Boats (100 mL) Amazon  mdo-azoc-1030
poly(ethylene glycol)-dithiol (PEG-diSH; 3.4 kDa) Laysan Bio SH-PEG-SH-3400-5g
Polydimehylsiloxane (PDMS) [Slygard 182 Elastomer Kit] Elsworth Adhesives 3097358-1004 Polydimethylsiloxane
Powder Free Examination Gloves Quest 92897
Propidium iodide, 1 mg/mL aqueous soln.  Fisher Scientific  AAJ66584AB
RPMI-1640 Medium (1x) HyClone SH30027-02
Silicone spacers - Silicone sheet, 0.5 mm thick/13 cm x 18 cm Grace Bio-Labs JTR-S-0.5
SOX2 Alexa Fluor 488  Santa Cruz Biotechnology sc-365823
Tissue Culture Hood NUAIRE NU-425-600
Triethanolamine, ≥99.0% (GC)  Sigma Aldrich 90279
U-87 MG human glioblastoma cells American Type Culture Collection  HTB-14

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hirschhaeuser, F., et al. Multicellular tumor spheroids: an underestimated tool is catching up again. Journal of Biotechnology. 148 (1), 3-15 (2010).
  2. Costa, E. C., de Melo-Diogo, D., Moreira, A. F., Carvalho, M. P., Correia, I. J. Spheroids formation on non-adhesive surfaces by liquid overlay technique: Considerations and practical approaches. Biotechnology Journal. 13 (1), 1700417 (2018).
  3. Li, Y., Kumacheva, E. Hydrogel microenvironments for cancer spheroid growth and drug screening. Science Advances. 4 (4), eaas8998 (2018).
  4. Kamatar, A., Gunay, G., Acar, H. Natural and synthetic biomaterials for engineering multicellular tumor spheroids. Polymers. 12 (11), 2506 (2020).
  5. Wang, C., Tong, X., Yang, F. Bioengineered 3D brain tumor model to elucidate the effects of matrix stiffness on glioblastoma cell behavior using PEG-based hydrogels. Molecular Pharmaceutics. 11 (7), 2115-2125 (2014).
  6. Nakod, P. S., Kim, Y., Rao, S. S. Three-dimensional biomimetic hyaluronic acid hydrogels to investigate glioblastoma stem cell behaviors. Biotechnology and Bioengineering. 117 (2), 511-522 (2020).
  7. Xiao, W., et al. Bioengineered scaffolds for 3D culture demonstrate extracellular matrix-mediated mechanisms of chemotherapy resistance in glioblastoma. Matrix Biology. 85, 128-146 (2020).
  8. Pedron, S., et al. Hyaluronic acid-functionalized gelatin hydrogels reveal extracellular matrix signals temper the efficacy of erlotinib against patient-derived glioblastoma specimens. Biomaterials. 219, 119371 (2019).
  9. Hill, L., Bruns, J., Zustiak, S. P. Hydrogel matrix presence and composition influence drug responses of encapsulated glioblastoma spheroids. Acta Biomaterialia. 132, 437-447 (2021).
  10. Chen, J. -W. E., et al. Crosstalk between microglia and patient-derived glioblastoma cells inhibit invasion in a three-dimensional gelatin hydrogel model. Journal of Neuroinflammation. 17 (1), 346 (2020).
  11. Thakuri, P. S., Liu, C., Luker, G. D., Tavana, H. Biomaterials-based approaches to tumor spheroid and organoid modeling. Advanced Healthcare Materials. 7 (6), 1700980 (2018).
  12. Shin, S., et al. Alginate-marine collagen-agarose composite hydrogels as matrices for biomimetic 3D cell spheroid formation. RSC Advances. 6 (52), 46952-46965 (2016).
  13. Pradhan, S., Clary, J. M., Seliktar, D., Lipke, E. A. A three-dimensional spheroidal cancer model based on PEG-fibrinogen hydrogel microspheres. Biomaterials. 115, 141-154 (2017).
  14. Imaninezhad, M., Hill, L., Kolar, G., Vogt, K., Zustiak, S. P. Templated macroporous polyethylene glycol hydrogels for spheroid and aggregate cell culture. Bioconjugate Chemistry. 30 (1), 34-46 (2018).
  15. Mirab, F., Kang, Y. J., Majd, S. Preparation and characterization of size-controlled glioma spheroids using agarose hydrogel microwells. PLoS One. 14 (1), e0211078 (2019).
  16. Razian, G., Yu, Y., Ungrin, M. Production of large numbers of size-controlled tumor spheroids using microwell plates. Journal of Visualized Experiments: JoVE. 81, e50665 (2013).
  17. Timmins, N. E., Nielsen, L. K. Generation of Multicellular Tumor Spheroids by the Hanging-Drop Method. Hauser, H., Fussenegger, M. 140, Springer, Humana Press, NJ. (2007).
  18. Zhao, L., et al. A 3D printed hanging drop dripper for tumor spheroids analysis without recovery. Scientific Reports. 9 (1), 19717 (2019).
  19. Amaral, R. L., Miranda, M., Marcato, P. D., Swiech, K. Comparative analysis of 3D bladder tumor spheroids obtained by forced floating and hanging drop methods for drug screening. Frontiers in Physiology. 8, 605 (2017).
  20. Gencoglu, M. F., et al. Comparative study of multicellular tumor spheroid formation methods and implications for drug screening. ACS Biomaterials Science & Engineering. 4 (2), 410-420 (2018).
  21. Zhang, C., Liu, C., Zhao, H. Mechanical properties of brain tissue based on microstructure. Journal of the Mechanical Behavior of Biomedical Materials. 126, 104924 (2021).
  22. Alifieris, C., Trafalis, D. T. Glioblastoma multiforme: Pathogenesis and treatment. Pharmacology & Therapeutics. 152, 63-82 (2015).
  23. Zustiak, S. P., Leach, J. B. Hydrolytically degradable poly (ethylene glycol) hydrogel scaffolds with tunable degradation and mechanical properties. Biomacromolecules. 11 (5), 1348-1357 (2010).
  24. Zustiak, S. P., Wei, Y., Leach, J. B. Protein-hydrogel interactions in tissue engineering: Mechanisms and applications. Tissue Engineering Part B: Reviews. 19 (2), 160-171 (2013).
  25. Kroger, S. M., et al. Design of hydrolytically degradable polyethylene glycol crosslinkers for facile control of hydrogel degradation. Macromolecular Bioscience. 20 (10), 2000085 (2020).
  26. Raeber, G., Lutolf, M., Hubbell, J. Molecularly engineered PEG hydrogels: a novel model system for proteolytically mediated cell migration. Biophysical Journal. 89 (2), 1374-1388 (2005).
  27. Bruns, J., Egan, T., Mercier, P., Zustiak, S. P. Glioblastoma spheroid growth and chemotherapeutic responses in single and dual-stiffness hydrogels. Acta Biomaterialia. 163, 400-414 (2023).
  28. Kuwajima, T., et al. ClearT: a detergent-and solvent-free clearing method for neuronal and non-neuronal tissue. Development. 140 (6), 1364-1368 (2013).
  29. Holt, S. E., Ward, E. S., Ober, R. J., Alge, D. L. Shooting for the moon: using tissue-mimetic hydrogels to gain new insight on cancer biology and screen therapeutics. MRS Communications. 7 (3), 427-441 (2017).
  30. Jain, E., Scott, K. M., Zustiak, S. P., Sell, S. A. Fabrication of polyethylene glycol-based hydrogel microspheres through electrospraying. Macromolecular Materials and Engineering. 300 (8), 823-835 (2015).
  31. Raghavan, S., et al. Comparative analysis of tumor spheroid generation techniques for differential in vitro drug toxicity. Oncotarget. 7 (13), 16948 (2016).
  32. Lee, K. -H., Kim, T. -H. Recent advances in multicellular tumor spheroid generation for drug screening. Biosensors. 11 (11), 445 (2021).

Tags

هذا الشهر في JoVE ، العدد 199 ، التغليف ، الهلاميات المائية المصنوعة من البولي إيثيلين جلايكول ، الدراسة ، تفاعلات المصفوفة الكروية ، تغليف 3D ، البيئة المكروية للورم ، نمو الخلايا ، نموذج في المختبر ، نموذج الورم الأرومي الدبقي ، قوالب microwell الهرمية ، الأحجام الخاضعة للرقابة ، Polydimethylsiloxane ، الهلاميات المائية القائمة على PEG ، خصائص الهيدروجيل ، الصلابة ، التحلل ، التصاق الخلية ، هيدروجيل ناعم ، تلطيخ ، مجهر متحد البؤر ، قلب كروي ، محيط ، محلول المقاصة
تصنيع وتغليف كروي للورم في الهلاميات المائية المصنوعة من البولي إيثيلين جلايكول لدراسة تفاعلات المصفوفة الكروية
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Bruns, J., Nejat, S., Faber, A.,… More

Bruns, J., Nejat, S., Faber, A., Zustiak, S. P. Tumor Spheroid Fabrication and Encapsulation in Polyethylene Glycol Hydrogels for Studying Spheroid-Matrix Interactions. J. Vis. Exp. (199), e65515, doi:10.3791/65515 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter