Drosophila Egg-Laying Præference Assay: En metode til at teste beslutningsprocessen i Fluer

Overview

Drosophila hunner vælger mellem substrater og udvalgte steder, der er attraktive for æglægning. Denne video beskriver en adfærdsmæssig analyse, der tester deres beslutningstagning, kaldet æglægning præference assay. Det fremhævede klip demonstrerer proceduren med en specialbygget opsætning, som gør det muligt for forskere ikke kun at teste mange kvinders adfærd på samme tid, men er også kompatibel med videooptagelse og optogenetiske opsætninger.

Protocol

Denne protokol er et uddrag fra Gou et al., High Throughput Assay at undersøge Egg-Laying Præferencer individuelle Drosophila melanogaster, J. Vis. Exp. (2016).

1. Kammerkonstruktion, Montage, Assay Setup

1. Få et maskinværksted til at bygge akrylæglægningskamre(figur 1A-D). Maskintegningen af forskellige stykker er vist i supplerende figur 1-3. Billeder i høj opløsning kan også findes her (http://www.rebeccayang.org/pdf/chamber%20design.pdf).
2. Plastplader indsættes i kammerets (øverste) stykke som vist i figur 1C. Dette tjener som den nederste overflade, mens lastning flyver ind i de enkelte æglægning arenaer.
3. Bedøve hunner på en CO₂ pad og indlæse dem individuelt i hver æglægning arena. Tillad ~ 30 min for fluer at komme sig efter CO₂ og blive akklimatisering til det nye miljø.
4. Forbered agarose substraterne.
   1. For nemheds skyld skal du opbevare en færdig flaske smeltet 1% agarose i et 55 °C vandbad.
   2. Den ønskede mængde saccharoseopløsning (2 M) tilsættes i et 50 ml konisk rør og blandes med en passende mængde agarose. For eksempel at forberede 150 mM saccharosesubstrat skal der anbringes 750 μl 2 M saccharoseopløsning i røret og derefter fylde røret med agarose til 10 ml mærket.
   3. Det almindelige substrat fremstilles på samme måde, men der tilsættes destilleret vand i stedet for saccharoseopløsning.
      BEMÆRK: Den endelige koncentration af agarose i denne protokol er lidt mindre end 1%. Det er vores erfaring, at den nøjagtige koncentration af agarose ikke betyder noget, så længe den er kontrolleret til at være inden for ~ 0,9 - 1,1%, og at de to substrater er af samme agarosekoncentration.
5. Tag underlaget (nederst) stykke af kammeret og pipette 1.000 μl agarose substrat i hvert trug som det ses i figur 1D.
6. Lad agarose størkne i ~ 30 min.
7. Når agarose substrater og fluer er klar, samle alle tre stykker af æglægning kammer og derefter tage ud plastplader.
8. Placer kamrene i flyveinkubatorer.
   BEMÆRK: Længden af æglægningseksperimenter kan variere afhængigt af eksperimentelle behov. Vi kører typisk eksperimentet O/N (14 - 16 timer). Der blev heller ikke observeret nogen signifikant indvirkning af døgnrytmens timing på æglægningspræferencer.
9. Bedøve hunner ved at indsprøjte CO₂ i kammeret. Demontere kammeret, kassér bedøvede fluer i flue lighus(dvs.en tom kaffe kan fyldes med nogle majsolie). Tag billeder af resultaterne til registrering (se figur 2).
10. Tæl antallet af æg manuelt, og beregn præferenceindekser til analyse. Beregne præferenceindekset som (N_a - N b)/(N_a + N_b), hvor N_a og N_b repræsenterer antallet af æg på henholdsvis stedet og stedet b.

Representative Results

Figur 1: Æglægningskamre og æglægningsprotokol. (A)Fuldt samlet æglægningskammer. (B)Adskilte stykker. a: lastestykket (øverst), b: skillestykket (midten), c: substratet (nederste) stykke. Maskintegninger af disse stykker er vist i supplerende figur 1-3. (C)Kammerets læssestykke. a': skydedøre, a": skinner. Plastpladerne indsættes i lastestykket for at tjene som et gulv for at holde de indlæste fluer på plads. Vi lægger typisk farvebånd på kanten af plastpladerne (rød pil). (D) Underlaget (nederst) og kammerets skillestykker (midterste stykker). Agarose deponeres i individuelle trug for at tjene som æglægningssubstrater (pile). Quadrilateral skitserer æglægning arena for en enkelt flue. (E)Dag 0 for indsamlede hunner/hanner i et gæret hætteglas. (F) Dag 4 - 5 af indsamlede hunner/hanner i et gæret hætteglas. Bemærk, at larver og voksne kvinder har spist det meste af gæren, og overfladen af maden er blevet besat af larver. Den våde overflade mad, der kryber med larver, forhindrer kvinder i at lægge flere æg i hætteglasset. g) Skematisk analyse af protokollen for opstilling af æglægningsadfærdseksperimenter. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 2: Repræsentative æglægningsresultater for fluer, der vælger mellem saccharose og almindelige substrater. (A)Sidevisning af æglægningsresultater af vildtlevende typefluer, når de fik valget mellem saccharose (150 mM) og almindelige substrater. Hvid boks skitserer en æglægningsarena til en enkelt flue. (B) Topbillede af æglægningsresultater. Hvid boks skitserer en æglægningsarena til en enkelt flue. (C) Præferenceindeks (PI) af vild type flyver, når man bliver bedt om at vælge mellem et saccharoseholdigt substrat og et almindeligt substrat. PI beregnes for hver hun således: (antal æg på saccharosesubstrat - antal æg på de almindelige substrater) /samlet antal æg. Fejllinjen angiver SEM. Klik her for at få vist en større version af dette tal.

Supplerende figur 1: Maskintegninger til skillevæggen og substratstykket i kammeret. (A-A") Forskellige visninger af substratet stykke af kammeret. (B-B') Forskellige visninger af den midterste skillestykke stykke af kammeret. Klik her for at se en større version af dette tal.

Supplerende figur 2: Maskintegninger til kammerets læssestykke. (A-A') Forskellige visninger af det øverste lag af lastestykket i kammeret. (B-B') Forskellige visninger af det nederste lag af lastestykket i kammeret. Klik her for at se en større version af dette tal.

Supplerende figur 3: Maskintegning til skydedøren og skinnen på kammeret. (A)Skinnen fastgjort på det øverste stykke af kammeret. (B)Skydedøren til kammeret. Klik her for at se en større version af dette tal.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
UltraPure Agarose	Invitrogen	16500-500
Sucrose	Sigma	S0389
Water bath	Fisher	15-462-6Q
Egg-laying chambers	Custom Built
Fly vials (narrow)	Genesee	32-116BC