Ontwikkeling van een bio-hybride Mosquito Stinger-gebaseerde atoomkrachtmicroscopiesonde

Summary

Kwantitatief en gecontroleerd onderzoek naar het bijtgedrag van insecten is cruciaal voor het bedenken van effectieve strategieën om door vectoren overgedragen ziekten te bestrijden. In deze context wordt een methode geïntroduceerd voor het vervaardigen van een biohybride atoomkrachtmicroscopie (AFM) sonde.

Abstract

Muggen, berucht als de dodelijkste dieren voor de mens vanwege hun vermogen om ziekten over te dragen, vormen een aanhoudende uitdaging voor de volksgezondheid. De primaire preventiestrategie die momenteel wordt gebruikt, omvat chemische insectenwerende middelen, die vaak niet effectief blijken te zijn omdat muggen snel resistentie ontwikkelen. Daarom is de uitvinding van nieuwe preventieve methoden cruciaal. Een dergelijke ontwikkeling hangt af van een grondig begrip van het bijtgedrag van muggen, waardoor een experimentele opstelling nodig is die de werkelijke bijtscenario's nauwkeurig repliceert met controleerbare testparameters en kwantitatieve metingen. Om deze kloof te overbruggen, werd een bio-hybride atoomkrachtmicroscopie (AFM) sonde ontworpen, met een biologische angel - in het bijzonder, een mug labrum - als punt. Deze bio-hybride sonde, compatibel met standaard AFM-systemen, maakt een bijna-authentieke simulatie van het gedrag van de muggenpenetratie mogelijk. Deze methode markeert een stap voorwaarts in de kwantitatieve studie van bijtmechanismen, wat mogelijk kan leiden tot het creëren van effectieve barrières tegen door vectoren overgedragen ziekten (VBD's) en het openen van nieuwe wegen in de strijd tegen door muggen overgedragen ziekten.

Introduction

De Wereldgezondheidsorganisatie (WHO) meldde dat door vectoren overgedragen ziekten (VBD's) verantwoordelijk zijn voor meer dan 17% van alle infectieziekten, die wereldwijd meer dan 7,00,000 doden per jaar veroorzaken. Als dodelijkste dier ter wereld verspreiden muggen bijvoorbeeld tal van ziekteverwekkers, zoals dengue, malaria en zika, via bloedvoedende geleedpotigen, wat resulteert in 700 miljoen infecties per jaar¹. Verkenningen in de richting van de ontwikkeling van effectieve maatregelen om VBD's te voorkomen zijn van cruciaal belang, waaronder het nabootsen van het penetratiegedrag van muggen om hun bijtmechanismen te onderzoeken en studies van mogelijke barrières om hun werkzaamheid bij het voorkomen van penetratie te bewijzen. Een belangrijke uitdaging is het ontwikkelen van de juiste aanpak om dergelijke onderzoeken uit te voeren. Er zijn inspanningen geleverd in de literatuur, waaronder de ontwikkeling van naalden op microschaal die lijken op de geometrie van een muggenangel; veel van de materialen die worden gebruikt om deze micronaalden te maken (d.w.z. visco-elastische materialen², silicium (Si), glas, keramiek³, enz.) hebben echter andere mechanische eigenschappen dan het biologische materiaal van de slurf van de mug. De technische materialen kunnen broos zijn en vatbaar voor breuk en knikken ^3,4, terwijl de slurf van de mug beter bestand is tegen breuk of knikken⁴. Het voordeel van het hebben van een bio-hybride sonde die het labrum van een mug gebruikt in plaats van technische materialen, is dat het een nauwkeurigere weergave kan zijn van het doorboormechanisme van muggen. Ook moeten gespecialiseerde gereedschappen worden geïntegreerd met micronaalden om kwantitatieve studies uit te voeren, zoals de nauwkeurige meting van kracht⁵, wat niet gemakkelijk te bereiken is met op maat gemaakte opstellingen met behulp van technische micronaalden.

Atoomkrachtmicroscopie (AFM) gebaseerde benadering is veelbelovend in die zin dat het werkt door gebruik te maken van een cantilever met een ultrafijne punt die zorgvuldig dicht bij het oppervlak van een monster wordt geplaatst. De punt kan over een oppervlak scannen of ernaar/in worden gedrukt, waarbij verschillende aantrekkende of afstotende krachten worden ervaren als gevolg van de interacties met een monster⁶. Deze interacties leiden tot de afbuiging van de uitkraging, die wordt gevolgd door de weerkaatsing van een laserstraal vanaf de bovenkant van de uitkraging op een fotodetector⁶. De uitzonderlijke gevoeligheid voor beweging van het systeem stelt AFM in staat om een breed scala aan metingen uit te voeren, met inbegrip van maar niet beperkt tot morfologische kartering met picometernauwkeurigheid, krachtmetingen variërend van piconewton tot micronewton, en uitgebreide multifysische onderzoeken⁷. Bijvoorbeeld, AFM-inkepingen kunnen worden uitgevoerd om de reactie op de uitgeoefende kracht van een monster nauwkeurig te beoordelen en ook om de hardheid, elasticiteit en andere mechanische eigenschappen van een monster te meten door koppeling met geschikte analytische modellen⁸. De sonde van AFM wordt meestal gemaakt van silicium (Si) of siliciumnitride (Si₃N₄)⁸ met een lengte van 20-300 μm⁹ en een eindstraal in de orde van enkele tot tientallen nanometers¹⁰. De tipradius van de nanometerschaal kan ideaal zijn voor toepassingen zoals beeldvorming met hoge resolutie; Het heeft echter niet de kenmerken van biologische stingers voor studies die penetratiegedrag proberen na te bootsen in termen van stijfheid, straal, vorm en beeldverhouding. De micronaaldstructuur van een mug is bijvoorbeeld de fascikel, die een beeldverhouding heeft van ~60¹¹ (lengte ~1,5 mm tot 2 mm; diameter ~30 μm)¹². Hoewel een conventionele AFM-sonde kan worden verondersteld te lijken op een biologische angel zoals een labrum, zullen de verschillende materiaaleigenschappen en afmetingen niet de werkelijke situatie tijdens een beet weerspiegelen.

Om kwantitatief onderzoek van penetratiegedrag mogelijk te maken dat biologische beten van insecten of andere dieren met stingers nabootst, hier, een proces om bio-hybride AFM-cantilevers met een biologische stinger te fabriceren terwijl zijn uiteinde wordt ontwikkeld. Als casestudy werd met succes een AFM-uitkraging gedemonstreerd met de punt van een muggenlabrum eraan. Gebruikmakend van bestaande informatie uit de literatuur over de typische invoegkrachten die een mug gebruikt om door de huid van een slachtoffer te doorboren^12,13, kan deze bio-hybride AFM-cantilever mogelijk bijna-echte nabootsing van muggenbeten onder een regelmatige AFM mogelijk maken. Het protocol van het hefboomgebruik van micro- biologische stingers om bio-hybride AFM-cantilevers te fabriceren kan ook aan de ontwikkeling van andere scherpe stinger-gebaseerde biohybride AFM-cantilevers voor kwantitatief onderzoek van een verscheidenheid van het bijten mechanismen worden toegepast.

Terminologieën
Een schema van een proboscis en zijn componenten van belang worden weergegeven in figuur 1, en hun definities zijn (1) Proboscis: een lichaamsdeel uit de mond van een mug dat de mug in staat stelt zichzelf te voeden, met een kern-schaalstructuur bestaande uit de fascikel (kern) en het labium (schaal), (2) Labium: de donkere en stompe buitenkant van een proboscis², (3) Fascikel: een groep slanke naalden in het labium, waaronder twee bovenkaakjes, twee onderkaken, een hypofarynx en een labrum², (4) Hypofarynx: verantwoordelijk voor het afscheiden van speeksel in de bloedbaan van de gastheer², (5) Maxillae: gekarteld lid dat helpt bij het voedingsmechanisme², (5) Onderkaken: vergelijkbaar met de bovenkaak, helpen ze de mug bij het voedingsmechanisme en hebben ze een scherpe punt², (6) Labrum: het belangrijkste lid om de huid van een slachtoffer binnen te dringen, dat veel groter is dan de bovenkaak, onderkaken en hypofarynx. Het heeft ook sensorische structuren die het mogelijk maken om bloedvaten en interne kanalen onder de huid te vinden², (7) Manipulator: een assemblage met drie vrijheidsgraden en nauwkeurigheid op micronschaal voor positionering, waardoor beweging in XYZ-richtingen mogelijk is, (8) Clamp-assemblage: een op maat gemaakte 2-delige klem gemonteerd op de manipulator die wordt gebruikt om de tiploze AFM-cantilever tijdens het experiment vast te klemmen.

Protocol

De muggensoort die voor dit protocol wordt gebruikt, is een niet-geïnfecteerde volwassen vrouwtje Aedes aegypti (A. aegypti), ingevroren ontvangen en bewaard in een vriezer van -20 °C. De soort werd geleverd door het NIH/NIAID Filariasis Research Reagent Resource Center voor distributie via BEI Resources, NIAID, NIH: Uninfected Aedes aegypti, Strain Black Eye Liverpool (Frozen), NR-48920. De reagentia en apparatuur die voor het onderzoek zijn gebruikt, staan vermeld in de materiaaltabel.

1. Het labium van de proboscis ontleden

1. Plaats met een pincet een dode mug op een glasplaatje onder de microscoop en zorg ervoor dat er een taps toelopende punt aan het uiteinde van de slurf zit (Figuur 2A).
2. Terwijl u de mug op het glasplaatje houdt, plaatst u een scalpelmesje voorzichtig over het labium bij de kop van de mug (Figuur 2B).
3. Maak vervolgens een incisie over de gehele bovenste helft van het labium (een snede van ongeveer 80 μm) met een geringe penetratiediepte door de dikte van het labium. Zorg ervoor dat u een lichte druk op het mes uitoefent om alleen het labium te snijden, maar niet de fascikel die eronder ligt.
4. Houd met een pincet de kop van de mug stevig vast en knijp met een ander precisiepincet lichtjes in het labium op elke positie tussen de taps toelopende punt en de locatie van de incisie (Figuur 2B).
   1. Trek het pincet dat het labium vasthoudt in de richting van de taps toelopende punt (Figuur 2C). Blijf aan het pincet trekken totdat het labium is losgescheurd en volledig van de fascikel is verwijderd.
5. Leg de mug onder de microscoop en controleer of de punt van het labrum aanwezig is. Dit is te herkennen aan de aanwezigheid van een taps toelopende punt op de fascikel (Figuur 2D).

2. De punt van het labrum scheiden van de andere fascikelleden

1. Klem en sluit de punten van een precisiepincet en plaats de punt van het pincet direct naast het labrum bij de punt.
2. Gebruik de punt van het pincet om een lichte kracht op het labrum uit te oefenen in de richting loodrecht op de lengte van de fascikel (Figuur 3A).
3. Blijf het labrum over het glasplaatje duwen totdat het labrum is gescheiden van de andere delen van de fascikel.
4. Inspecteer het monster onder de microscoop om er zeker van te zijn dat de juiste scheiding tussen het labrum en andere fascikelleden is bereikt (Figuur 3, links). Als de scheiding niet lukt, ga dan terug naar stap 2.1.

3. De punt van het labrum afsnijden

1. Terwijl het labrum nog op het glasplaatje ligt, plaatst u een scalpelmesje over het labrum op een afstand van ongeveer ~200 μm van de punt van het labrum (Figuur 4A). Oefen voorzichtig voldoende druk uit en snijd de punt van het labrum helemaal door. Hoewel de labrumpunt idealiter zo kort mogelijk moet zijn, is ~200 μm het beste wat de huidige aanpak aankan.
2. Meet de lengte van het gesneden labrum om er zeker van te zijn dat het niet langer is dan 300 μm (Figuur 4B) met behulp van digitale meetsoftware. In dit protocol werd ImageJ gebruikt¹⁴.

4. De punt van het labrum vastpakken

1. Lokaliseer en isoleer met een precisiepincet de punt van het labrum op het glasplaatje. Gooi elk deel dat op het objectglaasje achterblijft, behalve de punt van het labrum, weg.
2. Knijp met hetzelfde precisiepincet langzaam en licht in het labrum zodat het afgeknipte uiteinde vrij en vrij is van het pincet. Zorg er ook voor dat de oriëntatie van het labrum evenwijdig is aan de richting van de lengte van het pincet en dat het afgeknipte uiteinde van het labrum weg wijst van het lichaam van het pincet.
3. Zodra het preparaat stevig is samengeknepen, verwijdert u de klemkracht die de punten van het pincet bij elkaar houdt. De punt van het labrum blijft aan een van de punten van het pincet plakken.
4. Inspecteer onder een microscoop de punten van het pincet en zorg ervoor dat de punt van het labrum aanwezig is op een van de punten van het pincet (Figuur 5). Als de punt van het labrum niet op het pincet zit, ga dan terug naar stap 4.2 en als de punt van het labrum niet op het pincet of op het glasplaatje zit, ga dan terug naar stap 1.

5. Epoxy aanbrengen op de uitkragende balk

1. Plaats een druppel (~0,05 ml) epoxy op de rand van een nieuw objectglaasje door de lijm direct uit de originele fles/verpakking te gieten. Plaats het epoxyhoudende glasplaatje onder het sondestation en stel erop scherp.
2. Monteer de tiploze AFM-cantilever op de clamp-assemblage door de basis (dwz het grotere uiteinde) vast te zetten, waarbij het cantileveruiteinde vrij blijft en in de ruimte hangt. Zorg ervoor dat de onderkant van de AFM-uitkraging naar beneden wijst.
3. Monteer de manipulator op het sondestation.
4. Breng de Z-as van de manipulator omhoog naar een positie waar de tiploze cantilever zich enkele millimeters boven de epoxyhoudende glasplaat bevindt.
5. Verplaats de manipulator handmatig zodanig dat de kantelloze uitkraging zichtbaar is in het veldzicht van de camera op het sondestation.
6. Beweeg met behulp van de manipulator de AFM-cantilever langs de X- en Y-richtingen totdat de punt van de cantilever direct boven de epoxy op de rand van de glasplaat rust.
7. Gebruik de manipulator opnieuw en laat de kantelloze cantilever langzaam in de Z-richting over de rand van het glasplaatje zakken.
8. Terwijl de uitkraging wordt neergelaten en de glasplaat nadert, blijft u de uitkraging heel langzaam laten zakken totdat deze voor het eerst de epoxy raakt. Laat de uitkraging niet verder zakken.
9. Schakel de manipulator voorzichtig in om de uitkraging langzaam in de X- of Y-richting te bewegen en verwijder de uitkraging uit de plas epoxy door de uitkraging continu in de geselecteerde richting te bewegen totdat de uitkraging volledig is gescheiden van de epoxy op het glasplaatje. De uitkraging zonder punt moet een miniatuurbel van epoxy aan het uiteinde hebben, zichtbaar onder het sondestation.
10. Til de cantilever op in de Z-richting met behulp van de manipulator.

6. Hechting van de punt van het labrum aan de uitkragende balk

1. Draai de manipulator 90 graden om de lange as van de cantilever en laat de manipulator op zijn kant op het sondestation rusten. In deze configuratie zijn de diktes langs de lengte van de AFM-uitkraging in verticale richting.
2. Plaats het precisiepincet met de punt van het labrum onder de camera van het sondestation, zodat de volledige lengte van de punt van het labrum zichtbaar is op het computerscherm.
3. Plaats de manipulatoreenheid die de clamp en de tiploze cantilever onder de camera van het sondestation zodat de volledige lengte van de tipless cantilever zichtbaar is op de computermonitor.
4. Richt de microscoop van het sondestation op de punt van het labrum en de uitkraging zonder punt.
5. Oriënteer de uitkraging loodrecht op de punt van het labrum door de manipulator voorzichtig en handmatig te draaien (Figuur 6A).
6. Gebruik de vrijheidsgraden van de manipulator om de uitsteekbare draaglever langzaam in de XY-richtingen te bewegen, zodat de lijm op de uitkraging contact maakt met het afgesneden uiteinde van de punt van het labrum (Figuur 6B).
7. Hard de epoxy uit en verstevig de kruising tussen de uitkraging en het muggenlabrum.
8. Zodra de epoxy is uitgehard, schakelt u de manipulator voorzichtig in de XY-richtingen in en beweegt u de uitkraging weg van het pincet, waarbij u controleert of de punt van het labrum nu op de uitkragende balk zonder punt staat (Figuur 6C).

Representative Results

De beelden van de scanningelektronenmicroscopie (SEM) van de vervaardigde bio-hybride AFM-sonde kunnen in Figuur 7 worden gevonden. Het uiteinde van het labrum werd met succes vastgelijmd aan de uitkragende balk. Vanwege de natuurlijke kromming van muggensteken en de handmatige bediening van het gepresenteerde protocol, is het uiterst moeilijk om een uitkraging te verkrijgen met een steekpunt die perfect loodrecht op de uitkraging staat. De niet-gecentreerde hoek tussen de angel en een denkbeeldige middellijn loodrecht op de uitkraging is meestal ~10 graden. Hoewel het een veelvoorkomend probleem lijkt bij het monteren van een sonde op een AFM-cantilever¹⁵, moet de onbedoelde helling in aanmerking worden genomen bij het uitvoeren van kracht-/stressanalyse. Het zou interessant zijn voor toekomstige studies om zich te concentreren op het verbeteren van het fabricageprotocol en om studies uit te voeren met behulp van de bio-hybride sonde. Dit is de eerste poging om een bio-hybride AFM-sonde te maken met behulp van de angel van een insect.

Figuur 1: Schema van de slurf van een mug. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 2: Verwijdering van het labium van een mug proboscis. (A) Een mug met een volle proboscis die de aanwezigheid van de intacte taps toelopende punt vertoont. (B) De locatie van de labiumincisie en de plaatsing van het pincet op het labium tijdens het labiumverwijderingsproces. (C) De richting van het trekken van het pincet tijdens het verwijderen van het labium. (D) De uiteindelijke ontlede fascikel met een intacte punt na verwijdering van het labium, met de taps toelopende labrumpunt nog aanwezig en intact. Schaalbalken: 200 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 3: Scheiding van het labrum van ongewenste staafdelen. (A) Plaats van de plaatsing van het pincet en richting van het duwen van het pincet als techniek om de proboscis fascikelleden te scheiden. (B) Proboscis na te zijn gemanipuleerd om het labrum te scheiden van andere fascikelleden. Schaalbalken: 200 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 4: Isolatie van de gewenste labrumpunt voor montage op de AFM-uitkraging. (A) De locatie van de labrumincisie voor het verwijderen van de punt van het labrum. Schaalbalk: 200 μm. (B) De punt van het labrum, eenmaal uit het lichaam van het labrum gesneden, meet ongeveer 200-300 μm lang. Schaalbalk: 50 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Afbeelding 5: De punt van het labrum op een pincet monteren vóór het lijmproces. De punt van het labrum plakte aan de punt van een van de pincetten, met het ongesneden uiteinde van het labrum vrij en weg van het lichaam van het pincet. Schaalbalk: 200 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Afbeelding 6: Sequentie voor het monteren van de punt van het labrum op de uitkraging zonder punt. (A) Oriëntatie van de uitkraging van de punt in een loodrechte positie ten opzichte van het labrum. (B) Het samenvoegen van de uitkraging van de puntloze cantilever met het labrum en het uitharden van de epoxylijm die wordt gebruikt om de verbinding tussen de twee componenten te verstevigen. (C) De uiteindelijke uitgeharde bio-hybride AFM-sonde zonder dat het labrum door het pincet wordt ondersteund. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 7: SEM-beelden van de bio-hybride AFM-sonde. (A) Een globaal overzicht van de punt van het labrum en de uitkraging zonder punt. Schaalbalk: 200 μm. (B) Een vergrote weergave van de punt van het labrum. Schaalbalk: 50 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Discussion

Stap 1 van het protocol is bedoeld om het biologische monster te reinigen van het ongewenste labium. Om dit te bereiken wordt een incisie gemaakt op het labium, maar niet op de fascikel, die direct onder het labium rust (Figuur 1). Omdat de fascikel en het labium niet aan hun grensvlak met elkaar zijn verbonden (d.w.z. het labium kan vrij langs de fascikel glijden en wordt alleen op zijn plaats gehouden door zijn bevestiging aan de muggenkop), is de uitgevoerde incisie bedoeld om een deel van het labium van de kop van de mug te scheiden, waardoor het verwijderen van de buitenste laag wordt vergemakkelijkt. Terwijl het labium uit het monster wordt getrokken, zou de technicus een lichte weerstand moeten ervaren die wordt veroorzaakt door de onderste helft van het labium die nog aan de mug vastzit. Verwacht wordt dat deze weerstandskracht relatief gemakkelijk zal vrijkomen, omdat de incisie de scheurvoortplanting van het biologische materiaal zal bevorderen, waardoor het ongesneden segment van het labium zal scheuren en het hele labium van de bundel zal glijden tijdens de trekkende actie. Als er onvoldoende incisie wordt gemaakt, kan de technicus overmatige weerstand ervaren tijdens het trekken en wordt hij aangemoedigd om nog een incisie te proberen voordat hij verder gaat met het protocol.

Het is belangrijk om in stap 1 en stap 4 een zachte aanraking en geduld uit te oefenen bij het manipuleren van het labrum via knijpen met een pincet. Hoewel het labrum relatief veerkrachtig is, kan het toch schade oplopen als het te agressief door het pincet wordt samengedrukt. De technicus wordt begeleid om lichtjes in het labium/labrum te knijpen, wat betekent dat hij de minimale hoeveelheid kracht moet uitoefenen die nodig is op het pincet om het labium/labrum vast te houden. Evaluatie van de aanwezigheid van schade kan worden uitgevoerd aan het einde van stap 1 en stap 4 bij het inspecteren van het monster onder de microscoop. Het wordt geadviseerd om de proboscis te inspecteren op eventuele afwijkingen over de lengte (d.w.z. deuken, scheuren, scheidingen in segmenten). Als het vermoeden bestaat dat een monster aan de punt van het labrum is beschadigd, gooi het dan weg en start het protocol opnieuw.

Belangrijke processtappen van het protocol, zoals stap 3 en stap 6, vereisen speciale zorg. Om stap 3 uit te voeren, moet de punt van het labrum handmatig met een scalpel worden gesneden. Te kort knippen zal de rest van het experiment exponentieel moeilijker maken omdat het te klein kan zijn om te manipuleren. Integendeel, als de punt meer dan 300 μm in lengte overschrijdt, wordt deze te lang om aan de AFM-uitkraging te worden gemonteerd vanwege de te grote loodrechte verschuiving die wordt geïntroduceerd tussen de labrumpunt en de AFM-uitkraging. Deze verschuiving wordt veroorzaakt door onvolkomenheden in het montageproces en/of een kromming die in het monster aanwezig kan zijn, die beide problematisch worden bij grotere labrumlengtes. Ook zullen cantilevers met zeer lange punten zeer moeilijk te gebruiken zijn onder de AFM. Tijdens stap 3 is het belangrijk op te merken dat alle fascikelstiletten (labrum, maxillae, onderkaken en hypofarynx) waarschijnlijk bij deze procedure zullen worden doorgesneden. Het labrum zal gemakkelijk kunnen worden gelokaliseerd en geïsoleerd van de resterende stiletten in stap 4 vanwege de handmatige scheiding die tijdens stap 2 is uitgevoerd. In stap 6, hoewel het bijna onmogelijk is om onder een optische microscoop te garanderen dat de punt volkomen normaal is ten opzichte van de uitkraging, is het nog steeds noodzakelijk om de hellingshoek te minimaliseren om ongewenste belastingsomstandigheden bij toekomstig gebruik te voorkomen.

Het is ook belangrijk om de juiste epoxy te kiezen voor de bevestiging van de stinger aan de AFM-cantilever. Er werden verschillende langzaam uithardende tweedelige epoxy's getest, die later niet ideaal bleken te zijn, omdat elke kleine trilling van de laboratoriumvloer tijdens het uithardingsproces ervoor kan zorgen dat het experiment mislukt. Zo werd uiteindelijk gekozen voor een UV-uithardende epoxy. De gebruikte lijm is een snel uithardende epoxy met een lage viscositeit die binnen 5 s na blootstelling aan UV-straling kan uitharden. Bij stolling wordt de lijm erg stijf en heeft hij een uitstekende sterkte, waardoor de gefabriceerde labrum-cantilever-sonde zich als een enkel lichaam gedraagt en niet faalt of vervormt op de plaats van hechting. Deze optie bood voldoende tijd vóór het uitharden om de opstelling in de juiste positie te configureren voor het hechten van de stinger aan de AFM-cantilever (stap 6.3), terwijl alle problemen met betrekking tot omgevingstrillingen als gevolg van het on-command uithardingsgedrag werden geëlimineerd.

De overige cruciale apparatuur in dit protocol is het sondestation, het scherpe pincet en de cantilever. Het gebruikte sondestation is uitgerust met een 5x lens die op de camera is gemonteerd; Het is echter niet essentieel om dit exacte model van het sondestation voor dit protocol te gebruiken. Bij het selecteren van het sondestation is de enige prioriteit om een duidelijk en gemakkelijk zicht op de AFM-uitkraging en het labrum te garanderen. De gebruikte scherpe pincetten hadden een puntgrootte van 0,5 mm bij 0,1 mm. Het is absoluut noodzakelijk om een pincet van deze puntafmeting of iets dergelijks te gebruiken, omdat het gebruik van een pincet met een lagere fijnheid tot problemen kan leiden tijdens de manipulatie van het labrum. De cantilever die in dit protocol wordt gebruikt, is afkomstig van een commerciële bron (zie Materiaaltabel). Dit vrijdragende model werd gekozen vanwege de hoge stijfheid, aangezien er een grote kracht moet worden overgebracht op de punt van de muggensonde om de echte huidpenetratie na te bootsen. Over het algemeen, voor alle stinger-gebaseerde sondes, kan een AFM-cantilever niet te zacht zijn omdat een gebrek aan stijfheid zal leiden tot buigen van de cantilever tijdens AFM-testen, wat op zijn beurt leidt tot een gebrek aan drukontwikkeling bij het stinger-sondepunt. Dit zal veroorzaken dat de sonde het stekende proces onnauwkeurig nabootst, waardoor hoogst stijve tipless AFM-cantilevers een vereiste voor dit protocol zijn.

Samengevat, heeft het unieke voordelen om een stinger-gebaseerde bio-hybride AFM-sonde voor kwantitatieve mechanische penetratie/bijtende studies te gebruiken in vergelijking met andere methoden die levende muggen en^{menselijke vrijwilligers} 4,11,12 vereisen om gelijkaardige studies uit te voeren. De ultrahoge waarnemingsresolutie van AFM kan meting met ongekende nauwkeurigheid mogelijk maken, en de bio-hybride sonde maakt een bijna-realistische emulatie van daadwerkelijke bijtscenario's mogelijk, met inbegrip van een statistisch significant aantal metingen zonder dat menselijke vrijwilligers nodig zijn ^4,11,12. Bovendien zijn de materialen die worden gebruikt voor het vervaardigen van gemanipuleerde micronaalden doorgaans vatbaar voor breuk of knikken ^3,4, wat niet representatief is voor de slurf van de mug. Het gebruik van de delen van de mug zelf lijkt beter op het echte bijtscenario. Dit protocol kan mogelijk verder worden ontwikkeld en geautomatiseerd voor productie met een hoge doorvoer. Ten slotte zou het ontwikkelde protocol mogelijk kunnen worden gebruikt om andere bio-hybride AFM-sondes te produceren die angelers van verschillende dieren gebruiken voor kwantitatieve studies van verschillende bijt/penetratiegedrag.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
5-SA-SE Straight Tapered Ultra Fine-Pointed Tweezers	Excelta	N/A	For manipulating/dissecting the proboscis.
C-4D Probe station	Everbeing Int’l Corp	N/A	Used for AFM assembly.
Tipless Tapping Mode Cantilever	NanoAndMore USA	TL-NCH	AFM cantilever used for mounting the labrum. Specs are shown here: Shape: Beam Force Constant: 42 N/m (10 - 130 N/m) Resonance Frequency: 330 kHz (204 - 497 kHz) Length: 125 µm (115 - 135 µm) Width: 30 µm (22.5 - 37.5 µm) Thickness: 4 µm ( 3 - 5 µm)
UV Expoxy	Let's resin	ALR00146	For stinger attachment.