القبض على الليزر Microdissection ذبابة الفاكهة الخلايا العصبية المحيطية
Summary
في هذه المقالة عن طريق الفيديو نقدم طريقة لعزل واحد أو عدة<em> ذبابة الفاكهة</em> دا الخلايا العصبية من اليرقات طور مرحلي ثالثة تستخدم في التقاط الأشعة تحت الحمراء (IR) فئة من التقاط Microdissection الليزر (LCM). ويمكن الحصول على الحمض النووي الريبي من الخلايا العصبية معزولة استخدامها بسهولة لتطبيقات المصب بما في ذلك qRT – PCR أو ميكروأري التحليلات.
Abstract
وتشجر شجيري (دا) الخلايا العصبية للنظام العصبي المحيطي ذبابة الفاكهة (PNS) توفير نظام نموذجا ممتازا للتحقيق فيها الآليات الجزيئية الكامنة وراء فئة محددة 1،2 تغصن التشكل. لتسهيل التحليلات الجزيئية لفئة محددة تنمية الخلايا العصبية دا ، فمن الأهمية بمكان الحصول على هذه الخلايا في السكان النقي. على الرغم من مجموعة من الخلايا المختلفة ، والأنسجة الخاصة العزلة تقنيات الحمض النووي الريبي وجود لخلايا ذبابة الفاكهة ، بما في ذلك تنقية خلية حبة المغناطيسي على 3،4 ، نيون الفرز الخلية المنشط (FACS) 5-8 ، والجيش الملكي النيبالي البروتين ملزمة تستند استراتيجيات 9 ، أي من ويمكن استخدام هذه الأساليب بسهولة لعزل واحد أو فئة محددة متعددة الخلايا العصبية دا ذبابة الفاكهة مع وجود درجة عالية من الدقة المكانية. وقد برز الليزر Microdissection التقاط (LCM) كأداة قوية للغاية والتي يمكن استخدامها لعزل أنواع معينة من الخلايا من الأنسجة المقاطع مع وجود درجة عالية من الدقة والقرار المكانية. ثم يمكن الحصول عليها من خلايا الحمض النووي الريبي معزولة يمكن استخدامها لتحليل بما في ذلك qRT – PCR وميكروأري التنميط التعبير ضمن نوع من الخلايا نظرا 10-16. حتى الآن ، LCM لم تطبق على نطاق واسع في تحليل الأنسجة والخلايا 17،18 ذبابة الفاكهة ، بما في ذلك الخلايا العصبية دا في المرحلة الثالثة اليرقات طور مرحلي للتنمية.
هنا نقدم لدينا بروتوكول الأمثل لعزل الخلايا العصبية دا ذبابة الفاكهة باستخدام الأشعة تحت الحمراء (IR) فئة من LCM. هذا الأسلوب يسمح للقبض على واحد الخلايا العصبية ، دا فئة محددة أو متعددة مع خصوصية عالية والقرار المكانية. العمر المتطابقة اليرقات طور مرحلي يعبر عن UAS third – mCD8 : 19 GFP التحوير تحت سيطرة إما الصف الرابع دا الخلايا العصبية المحددة PPK – 20 GAL4 السائق أو لعموم دا عصبون محددة 21-7 GAL4 – 21 واستخدمت لهذه السائق التجارب. الحمض النووي الريبي التي تم الحصول عليها من الخلايا العصبية معزولة دا هو من نوعية عالية جدا ، ويمكن استخدامها مباشرة لتطبيقات المصب ، بما في ذلك qRT – PCR أو ميكروأري التحليلات. وعلاوة على ذلك ، يمكن هذا البروتوكول LCM تكييفه بسهولة لالتقاط أنواع الخلايا الأخرى ذبابة الفاكهة a مراحل مختلفة من التنمية تعتمد على نوع من الخلايا المحددة ، ونمط التعبير GAL4 يحركها من GFP.
Protocol
Discussion
البروتوكول المقدمة في هذه الوثيقة توضح لنا طريقة الأمثل لعزل الخلايا العصبية الطرفية عن طريق ذبابة الفاكهة LCM. في حين تم تصميم هذا البروتوكول LCM للعزلة واحدة محددة ، والطبقة محددة أو متعددة الخلايا العصبية دا ذبابة الفاكهة من مرحلة اليرقات third طور مرحلي للت?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نشكر الدكاترة. Yuh – ننغ جان وGrueber ويس لتوفير مخزونات الطيران المستخدمة في هذه الدراسة ، وفرجينيا إسبينا ، والدكتور والدكتور ايمانويل Petricoin يوتا انس للحصول على مساعدة LCM. الكتاب يعترف F. توماس ميلر وكيت Jeffress الاستئماني التذكاري لدعم هذه البحوث (DNC) وجامعة جورج ماسون مكتب نائب مدير الجامعة ليالي (EPRI).
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| 10X Phosphate Buffered Saline (PBS) | MP Bioproducts | PBS10X02 | Diluted to 1X working solution | |
| 2.5% Trypsin | Sigma-Aldrich | T1426 | ||
| RNase-AWAY | Sigma-Aldrich | 83931 | ||
| Xylenes, histological grade | Fisher Scientific | X3S-4 | ||
| RNAse-free water | Fisher Scientific | BP561-1 | ||
| Optimal Cutting Temperature (OCT) compound | Tissue-Tek | 4583 | ||
| PicoPure RNA Isolation Kit | Molecular Devices | KIT0204 | Follow manufacturer’s instructions | |
| Thin walled reaction tube with domed cap | GeneAmp, Applied Biosystems | N8010611 | ||
| ExtracSure Sample Extraction Device | Molecular Devices | LCM 0208 | ||
| Incubation Block for sample extraction from CapSure HS Caps | Molecular Devices | LCM0505 | ||
| Alignment Tray for CapSure HS LCM Caps and ExtracSure Sample Extraction Devices | Molecular Devices | LCM0504 | ||
| CapSure HS LCM caps | Molecular Devices | LCM0213 | ||
| 75×100 mm glass slides | Fisher Scientific | 12-544-3 | ||
| Tissue embedding molds | Fisher Scientific | NC9642669 | ||
| Polypropylene pestle for 1.5 ml microcentrifuge tubes | USA Scientific | 1415-5390 | ||
| 70% Ethanol; 95% Ethanol; 100% Ethanol | ||||
| Dry ice |
Equipment:
- Cryostat
- 50 ml conical tube for slide fixation, rinsing, trypsin treatment and ethanol/xylene dehydration
- -80°C freezer
- Incubator
- PixCell IIe LCM Instrument with Fluor 300 epifluorescence optics optimized for EGFP (Molecular Devices-Molecular Devices)
References
- Corty, M. M., Matthews, B. J., Grueber, W. B. Molecules and mechanisms of dendrite development in Drosophila. Development. 136, 1049-1061 (2009).
- Parrish, J. Z., Emoto, K., Kim, ., Jan, Y. N. Mechanisms that regulate establishment, maintenance, and remodeling of dendritic fields. Annu. Rev. Neurosci. 30, 399-423 (2007).
- Wang, X., Starz-Gaiano, M., Bridges, T., Montell, D. Purification of specific cell populations from Drosophila tissues by magnetic bead sorting, for use in gene expression profiling. Nature Protocols. , (2008).
- Iyer, E. P. R., Iyer, S. C., Sulkowski, M. J., Cox, D. N. Isolation and purification of Drosophila peripheral neurons by magnetic bead sorting. J Vis Exp. 34, 2912-2917 (2004).
- Tirouvanziam, R., Davidson, C. J., Lipsick, J. S., Herzenberg, L. A., Tirouvanziam, R., Tirouvanziam, R. Fluorescence-activated cell sorting (FACS) of Drosophila hemocytes reveals important functional similarities to mammalian leukocytes. Proc. Natl. Acad. Sci. 101, 2912-2917 (2004).
- Shigenobu, S., Arita, K., Kitadate, Y., Noda, C., Kobayashi, S. Isolation of germline cells from Drosophila embryos by flow cytometry. Dev. Growth Differ. 48, 49-57 (2006).
- Reeves, N., Posakony, J. W. Genetic programs activated by proneural proteins in the developing Drosophila PNS. Dev. Cell. 8, 413-425 (2005).
- Jinushi-Nakao, S. Knot/Collier and Cut control different aspects of dendrite cytoskeleton and synergize to define final arbor shape. Neuron. 56, 963-978 (2007).
- Yang, Z., Edenberg, H. J., Davis, R. L. Isolation of mRNA from specific tissues of Drosophila by mRNA tagging. Nucl. Acids Res. 33, (2005).
- Appay, V. Sensitive Gene Expression Profiling of Human T Cell Subsets Reveals Parallel Post-Thymic Differentiation for CD4+ and CD8+ Lineages. J. Immunol. 179, 7406-7414 (2007).
- Ginzinger, D. G. Gene quantification using real-time quantitative PCR: An emerging technology hits the mainstream. Exp. Hematol. 30, 503-512 (2002).
- Keays, K. M., Owens, G. P., Ritchie, A. M., Gilden, D. H., Burgoon, M. P. Laser capture microdissection and single-cell RT-PCR without RNA purification. J. Immunol. Methods. 302, 90-98 (2005).
- Volgin, D. V., Swan, J., Kubin, L. Single-cell RT-PCR gene expression profiling of acutely dissociated and immunocytochemically identified central neurons. J. Neurosci. Methods. 136, 229-236 (2004).
- Emmert-Buck, M. R. Laser capture microdissection. Science. 274, 998-1001 (1996).
- Xiao, W. Gene expression profiling in embryonic mouse lenses. Mol. Vis. 12, 1692-1698 (2006).
- Scharschmidt, T. Analysis of human osteoarthritic connective tissue by laser capture microdissection and QRT-PCR. Connect. Tissue Res. 48, 316-323 (2007).
- Spletter, M. L. regulates Drosophila olfactory projection neuron identity and targeting specificity. Neural Dev. 2, 14-14 (2007).
- Hoopfer, E. D., Penton, A., Watts, R. J., Luo, L. Genomic analysis of Drosophila neuronal remodeling: a role for the RNA-binding protein Boule as a negative regulator of axon pruning. J. Neurosci. 28, 6092-6103 (2008).
- Lee, T., Luo, L. Mosaic analysis with a repressible cell marker for studies of gene function in neuronal morphogenesis. Neuron. 22, 451-461 (1999).
- Grueber, W. B. Projections of Drosophila multidendritic neurons in the central nervous system: links with peripheral dendrite morphology. Development. 134, 55-64 (2007).
- Song, W., Onishi, M., Jan, L. Y., Jan, Y. N. Peripheral multidendritic sensory neurons are necessary for rhythmic locomotion behavior in Drosophila larvae. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 104, 5199-5204 (2007).
- Espina, V. Laser capture microdissection. Nat. Prot. 1, 586-603 (2006).
- Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) method. Methods. 25, 402-408 (2001).
