Laser capture microdissectie van Drosophila Perifere neuronen
Summary
In deze video-artikel stellen we een methode voor het isoleren van een of meerdere<em> Drosophila</em> Da neuronen uit derde instar larven met behulp van de infrarood-capture (IR) klasse van de laser capture microdissectie (LCM). RNA verkregen uit de geïsoleerde neuronen kan gemakkelijk worden gebruikt voor downstream-toepassingen, waaronder qRT-PCR of microarray-analyses.
Abstract
De dendritische arborization (da) neuronen van de Drosophila perifere zenuwstelsel (PNS) bieden een uitstekend model systeem in om de moleculaire mechanismen die ten grondslag liggen klasse-specifieke dendriet morfogenese 1,2 onderzoeken. Ter bevordering van moleculaire analyses van de klasse-specifieke da neuron ontwikkeling, is het essentieel om deze cellen te verkrijgen in een zuivere populatie. Hoewel een waaier van verschillende cel en weefsel-specifieke RNA-isolatie technieken bestaan voor Drosophila cellen, met inbegrip magnetische bead gebaseerd cel zuivering 3,4, TL-Activated Cell Sorting (FACS) 5-8, en RNA-bindend eiwit op basis van strategieën 9, geen van deze methoden kunnen gemakkelijk worden gebruikt voor het isoleren van een of meerdere klasse-specifieke Drosophila da neuronen met een hoge mate van ruimtelijke precisie. Laser capture microdissectie (LCM) is naar voren gekomen als een zeer krachtig instrument dat kan worden gebruikt om specifieke soorten cellen te isoleren uit weefsel secties met een hoge mate van ruimtelijke resolutie en nauwkeurigheid. RNA verkregen uit geïsoleerde cellen kunnen vervolgens worden gebruikt voor analyses waaronder qRT-PCR en microarray expressie profilering binnen een bepaald celtype 10-16. Tot op heden is LCM niet op grote schaal toegepast in de analyse van Drosophila weefsels en cellen 17,18, inclusief da neuronen in de derde instar larvale stadium van ontwikkeling.
Hier presenteren we onze geoptimaliseerd protocol voor isolatie van Drosophila da neuronen met behulp van de infrarood (IR) klasse van LCM. Deze methode zorgt voor het vastleggen van enkele, klasse-specifieke of meerdere da neuronen met een hoge specificiteit en ruimtelijke resolutie. Leeftijd gematchte derde instar larven uitdrukken van een UAS-mCD8:: GFP 19 transgen onder de controle van zowel de klasse IV da neuron specifieke ppk-GAL4 20 driver of op de pan-da neuron specifiek 21-7 GAL4-21 driver werden gebruikt voor deze experimenten. RNA verkregen uit de geïsoleerde da neuronen is van zeer hoge kwaliteit en kunnen direct worden gebruikt voor downstream toepassingen, waaronder qRT-PCR of microarray-analyses. Bovendien kan deze LCM protocol gemakkelijk worden aangepast voor het vastleggen andere Drosophila soorten cellen een verschillende stadia van ontwikkeling afhankelijk van het celtype specifieke, GAL4 gedreven expressiepatroon van GFP.
Protocol
Discussion
Het protocol vermeld in dit document beschrijft onze geoptimaliseerde methode voor de isolatie van Drosophila perifere neuronen via LCM. Terwijl dit LCM-protocol is ontworpen voor de specifieke isolatie van enkele, klasse-specifieke of meervoudige Drosophila da neuronen uit de derde instar larvale stadium van ontwikkeling, kunnen kleine wijzigingen van het protocol gemakkelijk worden aangepast voor het vangen van andere Drosophila celtypen van alle ontwikkelings- fasen met behulp van verschill…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wij danken Drs. Yuh-Nung Jan en Wes Grueber voor het aanbieden van vliegen voorraden gebruikt in deze studie, en Virginia Espina, dr. Emanuel Petricoin en Dr Lance Liotta voor hulp bij LCM. De auteurs erkennen de Thomas F. en Kate Miller Jeffress Memorial Trust voor de ondersteuning van dit onderzoek (DNC) en de George Mason University Provost s Office (EPRI).
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| 10X Phosphate Buffered Saline (PBS) | MP Bioproducts | PBS10X02 | Diluted to 1X working solution | |
| 2.5% Trypsin | Sigma-Aldrich | T1426 | ||
| RNase-AWAY | Sigma-Aldrich | 83931 | ||
| Xylenes, histological grade | Fisher Scientific | X3S-4 | ||
| RNAse-free water | Fisher Scientific | BP561-1 | ||
| Optimal Cutting Temperature (OCT) compound | Tissue-Tek | 4583 | ||
| PicoPure RNA Isolation Kit | Molecular Devices | KIT0204 | Follow manufacturer’s instructions | |
| Thin walled reaction tube with domed cap | GeneAmp, Applied Biosystems | N8010611 | ||
| ExtracSure Sample Extraction Device | Molecular Devices | LCM 0208 | ||
| Incubation Block for sample extraction from CapSure HS Caps | Molecular Devices | LCM0505 | ||
| Alignment Tray for CapSure HS LCM Caps and ExtracSure Sample Extraction Devices | Molecular Devices | LCM0504 | ||
| CapSure HS LCM caps | Molecular Devices | LCM0213 | ||
| 75×100 mm glass slides | Fisher Scientific | 12-544-3 | ||
| Tissue embedding molds | Fisher Scientific | NC9642669 | ||
| Polypropylene pestle for 1.5 ml microcentrifuge tubes | USA Scientific | 1415-5390 | ||
| 70% Ethanol; 95% Ethanol; 100% Ethanol | ||||
| Dry ice |
Equipment:
- Cryostat
- 50 ml conical tube for slide fixation, rinsing, trypsin treatment and ethanol/xylene dehydration
- -80°C freezer
- Incubator
- PixCell IIe LCM Instrument with Fluor 300 epifluorescence optics optimized for EGFP (Molecular Devices-Molecular Devices)
References
- Corty, M. M., Matthews, B. J., Grueber, W. B. Molecules and mechanisms of dendrite development in Drosophila. Development. 136, 1049-1061 (2009).
- Parrish, J. Z., Emoto, K., Kim, ., Jan, Y. N. Mechanisms that regulate establishment, maintenance, and remodeling of dendritic fields. Annu. Rev. Neurosci. 30, 399-423 (2007).
- Wang, X., Starz-Gaiano, M., Bridges, T., Montell, D. Purification of specific cell populations from Drosophila tissues by magnetic bead sorting, for use in gene expression profiling. Nature Protocols. , (2008).
- Iyer, E. P. R., Iyer, S. C., Sulkowski, M. J., Cox, D. N. Isolation and purification of Drosophila peripheral neurons by magnetic bead sorting. J Vis Exp. 34, 2912-2917 (2004).
- Tirouvanziam, R., Davidson, C. J., Lipsick, J. S., Herzenberg, L. A., Tirouvanziam, R., Tirouvanziam, R. Fluorescence-activated cell sorting (FACS) of Drosophila hemocytes reveals important functional similarities to mammalian leukocytes. Proc. Natl. Acad. Sci. 101, 2912-2917 (2004).
- Shigenobu, S., Arita, K., Kitadate, Y., Noda, C., Kobayashi, S. Isolation of germline cells from Drosophila embryos by flow cytometry. Dev. Growth Differ. 48, 49-57 (2006).
- Reeves, N., Posakony, J. W. Genetic programs activated by proneural proteins in the developing Drosophila PNS. Dev. Cell. 8, 413-425 (2005).
- Jinushi-Nakao, S. Knot/Collier and Cut control different aspects of dendrite cytoskeleton and synergize to define final arbor shape. Neuron. 56, 963-978 (2007).
- Yang, Z., Edenberg, H. J., Davis, R. L. Isolation of mRNA from specific tissues of Drosophila by mRNA tagging. Nucl. Acids Res. 33, (2005).
- Appay, V. Sensitive Gene Expression Profiling of Human T Cell Subsets Reveals Parallel Post-Thymic Differentiation for CD4+ and CD8+ Lineages. J. Immunol. 179, 7406-7414 (2007).
- Ginzinger, D. G. Gene quantification using real-time quantitative PCR: An emerging technology hits the mainstream. Exp. Hematol. 30, 503-512 (2002).
- Keays, K. M., Owens, G. P., Ritchie, A. M., Gilden, D. H., Burgoon, M. P. Laser capture microdissection and single-cell RT-PCR without RNA purification. J. Immunol. Methods. 302, 90-98 (2005).
- Volgin, D. V., Swan, J., Kubin, L. Single-cell RT-PCR gene expression profiling of acutely dissociated and immunocytochemically identified central neurons. J. Neurosci. Methods. 136, 229-236 (2004).
- Emmert-Buck, M. R. Laser capture microdissection. Science. 274, 998-1001 (1996).
- Xiao, W. Gene expression profiling in embryonic mouse lenses. Mol. Vis. 12, 1692-1698 (2006).
- Scharschmidt, T. Analysis of human osteoarthritic connective tissue by laser capture microdissection and QRT-PCR. Connect. Tissue Res. 48, 316-323 (2007).
- Spletter, M. L. regulates Drosophila olfactory projection neuron identity and targeting specificity. Neural Dev. 2, 14-14 (2007).
- Hoopfer, E. D., Penton, A., Watts, R. J., Luo, L. Genomic analysis of Drosophila neuronal remodeling: a role for the RNA-binding protein Boule as a negative regulator of axon pruning. J. Neurosci. 28, 6092-6103 (2008).
- Lee, T., Luo, L. Mosaic analysis with a repressible cell marker for studies of gene function in neuronal morphogenesis. Neuron. 22, 451-461 (1999).
- Grueber, W. B. Projections of Drosophila multidendritic neurons in the central nervous system: links with peripheral dendrite morphology. Development. 134, 55-64 (2007).
- Song, W., Onishi, M., Jan, L. Y., Jan, Y. N. Peripheral multidendritic sensory neurons are necessary for rhythmic locomotion behavior in Drosophila larvae. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 104, 5199-5204 (2007).
- Espina, V. Laser capture microdissection. Nat. Prot. 1, 586-603 (2006).
- Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) method. Methods. 25, 402-408 (2001).
