Overview
このビデオでは、胸腔内注射を使用して、成体ゼブラフィッシュの心臓部に化合物を送達する技術について説明します。
Protocol
1. 胸部注射用魚の調製
- 成虫のゼブラフィッシュ(ダニオ・レリオ)を網で捕まえて麻酔液に移します。
- 1-2分後、魚が泳ぎ止め、オペルキュラムの動きを減らすと、プラスチックのスプーンで魚に触れて接触しないようにします。
- 素早く慎重に腹側を上にして、濡れたスポンジの溝にスプーンで魚を転送します。魚の頭は、オペレータの支配的な手から離れて指す必要があります。
2. 心膜へのマイクロインジェクション
- 実体顕微鏡では、魚の皮膚の下での鼓動の心臓の動きを注意深く観察する。鼓動心臓の上および腹側の心房で定義される三角形の真ん中の注入点を視覚的に決定 する(図1D)。キャピラリーの先端を、ボディ軸に対して相対的な角度を 30~45°に挿入します (図 1E)。マイクロキャピラリーの先端を用いて皮膚を心膜に静かに浸透させる (図1C)。最適なエントリポイントは、頭よりも腹部に近いです。
注: 毛細血管を身体や心臓に深く入れすぎないように、臓器に損傷を与えます。心臓穿刺の場合、針は一般的に血液で満たされる。この場合は、毛細血管を取り除き、実験から魚を除外します。 - 針が心膜の中に入ったら、マイクロインジェクター装置のペダルを押して完全に注入する。
注: 胸腔に空気を注入しないように注意してください。 - 注射後、胸郭から毛細血管をそっと引き出し、すぐに回収のためにシステム水でタンクに魚を移します。
- 麻酔からの完全な回復まで魚を監視します。
- 希望の時点で心臓を収集し、さらなる分析のためにそれを準備します。
注: 魚が30秒以内にオペルキュラの動きを再開しない場合は、プラスチックピペットでエラに水を絞って魚を再生物します。
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Representative Results
図1:成体ゼブラフィッシュにおける胸部内(IT)注射 (A)フィラメントを用いた細管(直径6インチ、直径1.0mm)のプルドマイクロ注射の写真と、使用するニードルプーラープログラムの値。(B)フィラメントを有するプルドマイクロインジェクション毛細管(直径6インチ、直径1.0mm)を10%フェノールレッドを含む溶液2.5μLで満たされた写真。針の引かれた先端は最大7mm長である。(C) ITインジェクション手順の概略表現。(D) ITインジェクション手順の写真。この図は、Biseらから修正されています。パネルCとDの数字は、手順の同じステップに対応する:(1)魚は、加湿されたスポンジの上に腹側を置かれる。穿刺部位(三角形の赤い点)は、エラの近くの胸の中央にあります。(2)針の心膜への浸透。赤い点は穿刺部位を示す。(3)注射は、心膜腔内の赤溶液の広がりを観察することによって監視される。(E) ITインジェクションのスキーム。注入毛細管と体の軸の間の角度は、心臓の穿刺を避けるために30°と45°の間でなければなりません。(F)示された体積のIT注入後1時間の魚の胸郭の写真。白い矢印は、内出血を示す可能性があり、再生組織を指しています
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Macroscope (binocular) | M400 | with Apozoom | |
| Micro-injector femtojet | Eppendorf | 5247 0034 77 | |
| Microloaders femtotips | Eppendorf | 5242 956.003 | |
| Micropipette glass needles type C | WPI | TW100F-6 | thin-wall capillary |
| Micropipette puller model P-87 | Flaming/Brown | 20081016 | filament box 2.5 mm x 4.5 mm |
| Sponge | any | any | dim. carved sponge 7cm x 3 cm x 1 cm |
| Tricaine (Anestethic) | Sigma | E10521 |
