Overview
Это видео описывает изоляцию раковых стволовых клеток от линий клеток рака молочной железы. Мы культурируем эти раковые стволовые клетки для генерации первичных маммосфер для оценки самообновления и расчета эффективности формирования сферы, что позволяет проводить сравнение по различным плотностям посева.
Protocol
1. Поколение первичных маммосфер из человеческих линий клеток рака молочной железы
ПРИМЕЧАНИЕ: Выполните следующие шаги под стерильным вытяжки культуры.
- Приготовьте Mammosphere Media, содержащий DMEM/F12, дополненный 2 мМ Л-глутамином, 100 U/ml пенициллином, 100 U/ml стрептомицином. Подготовка полного средства массовой информации непосредственно перед использованием, добавив 20 нг/мл рекомбинантный человеческий эпидермальный фактор роста (EGF; Sigma), 10 нг/мл рекомбинантного основного фактора роста фибробласта человека (bFGF; НИОКР систем) и 1x B27 дополнения.
- Аспиратные средства из колбы, содержащие адепт MCF-7 или MDA-MB-231 клетки (или линии раковых клеток молочной железы по вашему выбору; 70-80% слияния), мыть дважды в 1x PBS, и трипсинировать клетки.
- Клетки центрифуги при температуре 200 х г при комнатной температуре в течение 5 мин. Декант supernatant и resuspend клетки в 1-5 мл средств mammosphere. Pipette вверх и вниз, и при необходимости использовать 40 мкм ячейки ситечко крышка фильтра для получения одноклеточной подвески. Используйте гемоцитометр, чтобы обеспечить одноклеточную подвеску формируется (если нет, используйте 25 G иглы шприц подвески клетки до 3 раз).
- При необходимости изолировать CD44-CD24- клеточной подмножество через FACS с использованием анти-CD24-фикоэритрона (PE) и анти-CD44-фторцеин изотиоцианат (FITC) моноклональныеантитела 9. Кроме того, изолировать такую популяцию с помощью магнитно-активированной системы сортировки клеток (MACS) с анти-CD44 и анти-CD24-биотин комбинированных микробусов в соответствии с инструкциями производителя. Выполните положительный отбор с помощью столбцов LS и отрицательного отбора с помощью столбцов LD и подтвердите фенотипы всех изолированных клеток по цитометрии потока.
- Рассчитайте количество жизнеспособных ячеек на мл с помощью trypan blue.
ПРИМЕЧАНИЕ: Жизнеспособность клеток рассчитывается как количество жизнеспособных ячеек, разделенных на общее количество ячеек в сетках на гемоцитометре. Клетки, которые принимают трипан синий считаются не жизнеспособными. Следующая процедура используется для точного определения доли жизнеспособных клеток.- Подготовка 0,4% решение trypan синий в PBS. Добавьте 0,1 мл трепанового раствора синего бульона в 1 мл клеток. Загрузите гемоцитометр и осмотрите сразу под микроскопом при низком увеличении. Подсчитайте количество клеток и количество синих окрашивающих клеток. Жизнеспособные клетки ( 1,00 - (Количество ÷ и количество общих ячеек)» × 100.
- Чтобы рассчитать количество жизнеспособных клеток на мл культуры, используйте формулу ниже. Не забудьте исправить фактор разбавления.
Количество жизнеспособных клеток × 104 × 1,1 - клетки/мл культуры
- Повторное содержание заранее определенного количества клеток в 2 мл полных маммосферных средств массовой информации в каждом колодец 6-ну ультра-низкой адепт пластины. Плотность посева, как правило, 500-4000 клеток / см2 ячейки на колодец. Опционально используйте пластины с низким вложением 24 хорошо, в то время как посевные клетки одинаковой плотности в 0,5 мл мультимедиа.
ПРИМЕЧАНИЕ: Мы рекомендуем оптимизацию плотности посева и времени культуры для каждой линии клеток, представляющих интерес. - Инкубировать ультра низкой крепления 6-хорошо пластин при 37 градусов по Цельсию и 5% CO2 в течение 5-10 дней (в зависимости от клеточной линии и размера маммосферы), не нарушая пластин, особенно во время фазы роста в течение первых 5 дней.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
DMEM/F12 | Lonza | CC-3151 | |
2 mM L-glutamine | Sigma Aldrich | G8540 | |
100 U/ml Penicillin & Streptomycin | Sigma Aldrich | P4083 | |
20 ng/ml Recombinant human epidermal growth factor (EGF) | Sigma Aldrich | E9644 | |
20 ng/ml Recombinant human basic fibroblast growth factor (bFGF) | R&D systems | 233-FB-025 | |
1x B27 supplement | Invitrogen | 17504-044 | |
Phosphate buffered saline (PBS) | Thermo Scientific | 12399902 | |
0.5% trypsin/0.2% EDTA | Sigma Aldrich | 59418C | |
Fetal calf serum | First Link UK | 02-00-850 | |
Trypan blue | Sigma Aldrich | 93595 | |
Low attachment 6-well plates | Corning | CLS3814 |