Singola molecola Imaging dei trasporti nucleari

Summary

Microscopia singola molecola approch fornito intuizioni romanzo in trasporto nucleare.

Abstract

L'utilità dei singoli approcci di microscopia a fluorescenza molecola ha dimostrato di essere di avvalersi grande nel capire le reazioni biologiche negli ultimi dieci anni. L'indagine delle interazioni molecolari con alta risoluzione temporale e spaziale in profondità all'interno delle cellule è rimasta difficile a causa dei segnali intrinsecamente debole derivanti da singole molecole. Opere recenti di Yang et al. dimostrato che il piccolo campo epifluorescenza permette la visualizzazione di trasporto nucleocytoplasmic a livello di singola molecola. Con l'approccio singola molecola, la cinetica importanti, come il tempo di trasporto nucleare ed efficienza, per le molecole segnale carico-dipendenti e indipendenti sono stati ottenuti. Qui abbiamo descritto un protocollo per l'approccio metodologico con una migliore risoluzione spazio-temporale di 0,4 ms e 12 nm. La risoluzione migliore ci ha permesso di catturare transitori trasporto attivo ed eventi diffusione passiva attraverso i complessi poro nucleare (NPC) in semi-intatte le cellule. Ci aspettiamo che questo metodo da utilizzare per chiarire altri eventi vincolante e il traffico all'interno delle cellule.

Protocol

1. Preparazione del sistema cellulare per l'esperimento di singola molecola Almeno una settimana di anticipo, iniziare una nuova cultura della linea cellulare HeLa da uno stock di scongelamento a 37 ° C e mettendo in un centimetro 25 2 fiasco cultura dei media con 5 ml, Incubare le cellule a 37 ° C entro il 5% di CO 2 incubatore per 24 ore ed è diviso almeno 3 volte al fine di fornire una condizione ottimale per le cellule. Tuttavia le cellule non dovrebbe essere diviso più di 20…

Discussion

Bisogna fare attenzione ad assicurare un adeguato colocalizzazione di molecole NE e singolo durante l'esperimento. E 'inoltre importante fornire un alto rapporto segnale rumore, specialmente quando il segnale è basso a causa di etichettatura poveri o photobleaching. Precisione di localizzazione è limitata dal rumore di fondo (derivanti da out-of-focus fluorescenza, il rumore di lettura CCD, i fattori di corrente di buio e di altri).