RhoC GTPアーゼ活性化アッセイ
Summary
このプロトコルは、細胞内のアクティブなRhoC低分子量GTPaseのレベルを決定するためにプルダウンアッセイを利用しています。
Abstract
RhoC GTPアーゼは、RhoAのGTPアーゼ〜91％の相同性を持っています。ために細胞内での有病率から、RhoAのGTPアーゼのための多くの試薬および技術が開発されている。しかし、RhoC GTPアーゼは、比較的低レベルでの転移性癌細胞に発現している。したがって、少数のRhoC固有の試薬が開発されている。私たちはRhoC低分子量GTPaseを検出するためのRho活性化アッセイを適応している。この手法は、アクティブなRhoC GTPアーゼを引き出すためにGST – Rhoの結合ドメイン融合タンパク質を利用しています。さらに、我々は全体のレベル（GTPおよびGDP結合）RhoCのGTPアーゼを決定するアッセイの開始時に総タンパク質を収穫することができます。これは、セル内のアクティブな対総RhoC GTP加水分解酵素の測定が可能になります。この手順のいくつかの商用バージョンがしかし、市販のキットはRhoAのGTP加水分解のために最適化されており、通常はRhoC GTPアーゼのためにうまく動作しない開発されています。アッセイの部分はRhoC特異的抗体の開発だけでなく、変更されています。
Protocol
Discussion
手順の最も重要なステップは、新鮮なGST – RBDの世代です。このステップに細心の注意を払うために失敗は失敗の主な理由です。すべてのステップは、細胞溶解液（2.5）で一晩インキュベーションにGST – RBD（1.2）の世代から、一日で行う必要があります。もう一つの重要なステップは、細胞ライセートを生成するために十分な細胞があることを一定にすることです。セル内の低いレベルで存在?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
防衛W81XWH – 05 – 1 – 0005、W81XWH – 06 – 1から0495まで、W81XWH – 08 – 1から0029とW81XWH – 08 – 1から0356までの部
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Gluthione-sepharose 4B beads | GE Healthcare | 17-0756-01 | ||
| Criterion 4-20% Tris-HCl gels | BioRad | 345-0032 |
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