RhoC的GTP酶激活法
Summary
该协议利用上拉下来检测，以确定细胞内的活动中RhoC GTP酶的水平。
Abstract
RhoC的GTP酶有91％的同源性GTP酶RhoA的。由于其在细胞中的患病率，许多试剂和GTP酶RhoA的技术已经开发出来。然而，RhoC的GTP酶表达的转移性癌细胞处于较低水平。因此，数RhoC的特定试剂已经开发出来。我们已经适应了一个Rho的激活检测，检测RhoC的GTP酶。这种技术利用商品及服务税的Rho结合结构域融合蛋白拉出积极RhoC的GTP酶。此外，我们可以在检测开始收获总蛋白，以确定总水平（GTP和GDP结合）RhoC的GTP酶。这使得主动与总RhoC的GTP酶在细胞中的决心。此过程中的几个商业版本，但是已经开发，商业试剂盒优化GTP酶RhoA的，通常不工作中RhoC GTP酶。检测的部分已被修改，以及作为一个RhoC的特异性抗体的发展。
Protocol
1。准备GST融合蛋白 JM109感受态细菌，包含第一的N -端90个氨基酸的rhotekin Rho的结合域（RBD）的进入BamH1/EcoR1 pGEX3x载体亚克隆酸甘油。 为了确保高效率，必须执行以下步骤，每个实验。根据我们的经验，新鲜的GST – RBD的是一个强大的和准确的GTP酶激活检测的关键。 加入50微升（近似的，没有解冻）甘油50毫升的LB放大器和成长37℃摇动过夜。 1:10稀释500毫升LB放大器，?…
Discussion
该过程最关键的一步，是新鲜的GST – RBD的一代。密切关注到了这一步的失败是失败的主要原因。所有步骤，从GST – RBD的一代（1.2）孵育过夜的细胞裂解液（2.5），应在一天内完成。另一个关键的一步就是让某些有足够的细胞产生的细胞裂解液。这是在RhoC的GTP酶，它往往是在细胞水平低时，具有特别重要的意义。
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
国防部部W81XWH – 05 – 1 – 0005，W81XWH – 06 – 1 – 0495，W81XWH – 08 – 1 – 0029和W81XWH – 08 – 1 – 0356
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Gluthione-sepharose 4B beads | GE Healthcare | 17-0756-01 | ||
| Criterion 4-20% Tris-HCl gels | BioRad | 345-0032 |
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Cite This Article
Lucey, M., Unger, H., van Golen, K. L. RhoC GTPase Activation Assay. J. Vis. Exp. (42), e2083, doi:10.3791/2083 (2010).