Métodos para a preparação de um gel matriz injetável a partir de tecido decelularizado e injetá-lo em rato miocárdio<em> In vivo</em> São descritos.
Este protocolo fornece métodos para a preparação de um gel injetável matriz extracelular (ECM) para aplicações de engenharia de tecidos do miocárdio. Resumidamente, o tecido é decelularizado liofilizada, moída, enzimaticamente digerido, e então levadas ao pH fisiológico. A liofilização remove todo o conteúdo de água do tecido, resultando em ECM seco que podem ser moídos em um pó fino com um pequeno moinho. Depois da moagem, o pó ECM é digerida com pepsina para formar uma matriz de injetáveis. Após o ajuste para pH 7,4, o material da matriz líquido pode ser injetado no miocárdio. Resultados de ensaios de caracterização prévios mostraram que os géis matriz produzida a partir de decelularizado pericárdio e miocárdio conservar os componentes ECM nativa, incluindo diversas proteínas, peptídeos e glicosaminoglicanos. Dada a utilização deste material para engenharia de tecidos, na caracterização vivo é especialmente útil, aqui, um método para a realização de uma injeção intramural para o ventrículo esquerdo (VE) da parede livre é apresentado como um meio de analisar a resposta do hospedeiro ao gel matriz em um modelo animal de pequeno porte. Acesso à cavidade torácica é adquirida através do diafragma ea injeção é feita um pouco acima do ápice na parede livre do VE. O andaime biologicamente derivada pode ser visualizado por biotina rotulagem antes da injeção e, em seguida, coloração secções de tecido com um rabanete de cavalo conjugado com peroxidase neutravidin e visualização através de coloração diaminobenzidina (DAB). Análise da região de injeção também pode ser feito com coloração histológica e imuno-histoquímico. Desta forma, o gel previamente examinadas matriz de pericárdio e miocárdio foram mostrados a forma fibrosa, redes porosas e promover a formação de vasos na região da injeção.
Este método permite a geração de biologicamente derivada, andaimes injetável para a engenharia de tecidos do miocárdio. Embora estes métodos foram desenvolvidos inicialmente para a fabricação e testes in vivo de um gel matriz do miocárdio e apresentou aqui com um gel matriz de pericárdio, este protocolo pode ser adaptado para uso com qualquer tecido, desde que o tecido pode ser adequadamente descelularizados. Decelularização deve ser realizada e verificada antes da utilização destes métodos, como…
The authors have nothing to disclose.
Esta pesquisa foi financiada em parte pelo Programa Novo Diretor do NIH Innovator Award, que faz parte do Roteiro NIH para Pesquisa Médica, através de concessão de número 1-DP2-OD004309-01. SBS-N. gostaria de agradecer a NSF para uma Bolsa de Investigação Pós-Graduação.
Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
---|---|---|---|---|
Reagents: | ||||
Pepsin | Sigma-Aldrich | p6887-1G | Lyophilized | |
Biotin | Thermo Scientific | 21217 | ||
Neutravidin-HRP | Thomas Scientific | 21130 | ||
Equipment: | ||||
Wiley Mini Mill | Thomas Scientific | 3383L10 | ||
Labconco Lyophilizer | Labconco, Inc | 7670520 | ||
Surgical supplies: | ||||
Betadine | Purdue Products, L.P. | 67618-154-16 | ||
Lactated Ringers Solution | MWI | 003966 | ||
KY Jelly | MWI | 28658 | ||
Lidocaine, 2% | MWI | 17767 | ||
Buprenorphine hydrochloride | Reckitt Benckiser Healthcare (UK) Ltd. | 12496-0757-1 | ||
Artificial tear ointment | Fisher | NC9860843 | ||
Triple antibiotic ointment | Fisher | 19082795 | ||
Isoflurane | MWI | 60307-120-25 | ||
Otoscope | MWI | 008699 | ||
Stop cock | MWI | 006245 | ||
3-0 Vicrile suture | MWI | J327H | ||
5-0 Proline suture | MWI | s-1173 | ||
Reverse cutting (RC) needle | Ethicon | 8684G | ||
Microhemostats | Fine Science Tools | 13013-14 | ||
Rat tooth microforceps | Fine Science Tools | 11084-07 | ||
No. 10 scalpel | Fine Science Tools | 10110-01 | ||
Blunt scissors | Fine Science Tools | 14108-09 | ||
Sharp, curved scissors | Fine Science Tools | 14085-08 | ||
Large, serrated forceps | Fine Science Tools | 1106-12 | ||
PE160 suction tubing | BD | 427430 | ||
Clippers | MWI | 21608 | ||
Skin staples/stapler | Ethicon | PRR35 | ||
General supplies: | ||||
Stir plates | ||||
0.1 M HCl | ||||
1 M NaOH | ||||
10x PBS | ||||
1x PBS | ||||
70% Ethanol | ||||
0.1 mL syringes | ||||
10 mL syringe | ||||
Q-tips | ||||
Surgical glue | ||||
Surgical drape | ||||
Towel clamps | ||||
Small hand-held vacuum |