Анализ Шванн-астроцитов взаимодействий с использованием In Vitro Анализы
Summary
В этой статье намерен описать поэтапно часто используемых<em> В пробирке</em> Тесты, используемые при изучении Шванн клеточной asrtocyte взаимодействий.
Abstract
Шванн клетки являются одним из наиболее часто используемых клетками в ремонт стратегии следующие повреждения спинного мозга. Шванн клетки способны поддерживать аксонального регенерации и прорастанию на 1,2 секретирующие фактор роста и оказания содействия росту молекул адгезии 3 и внеклеточной матрицы молекул 4. Кроме того, они myelinate демиелинизированные аксонов в месте повреждения 5.
Однако после трансплантации, Шванн клетки не мигрируют с места имплантата и не смешиваются с принимающей астроциты 6,7. Это приводит к образованию резкой границы между клетками Шванн и астроцитов, создавая препятствие для роста аксонов пытается выйти трансплантата обратно в ткани хозяина проксимально и дистально. Астроциты в контакт с клетками Шванн также подвергаются гипертрофии и постоянно регулировать тормозное молекул 8-13.
В пробирке тесты были использованы для моделирования Шванн клеточных взаимодействий и астроциты играют важную роль в понимании механизмов, лежащих в основе сотовой поведения.
Эти тесты в пробирке включают границы анализа, где со-культуры осуществляется с помощью двух различных клеток каждого типа клеток занимающих разные территории только с небольшой разрыв, отделяющий два фронта клетки. Как клетки делятся и мигрируют, два сотовых фронтах стать ближе друг к другу и, наконец, сталкиваются. Это позволяет поведение двух клеточных популяций, которые будут проанализированы на границе. Другой вариант того же метода является сочетание двух клеточных популяций в культуре и в течение долгого времени два типа клеток выделять с клетками Шванн слипаются вместе, как между островами в астроциты вместе создание нескольких Шванн-астроцитов границ.
Второй анализа используются при изучении взаимодействия двух типов клеток является миграция анализа, где сотовая движение можно проследить на поверхности другого типа клеток монослоя 14,15. Этот анализ обычно известен как перевернутая анализа покровное. Шванн клетки культивируют на мельчайшие осколки стекла, и они обращены лицевой стороной вниз на поверхности астроцитов монослоев и миграции оценивается от края покровного.
И анализы играют важную роль в изучении основных механизмов, участвующих в клеточном изоляции и границы образования. Некоторые из молекул определяется с помощью этих методов включают N-Кадгерины 15, хондроитин сульфат протеогликаны (CSPGs) 16,17, FGF / Гепарин 18, Еф / Ephrins 19.
В этой статье намерен описать анализа границ и миграции в анализе поэтапно и выяснить возможные технические проблемы, которые могут возникнуть.
Protocol
Discussion
Анализы, описанные выше, были использованы в различных исследований, демонстрирующих роль несколько факторов, влияющих на формирование границы между Шванн-астроциты и ограниченной ячейке Шванн миграции в астроцитарных окружающей среды.
Понимание механизмов лежащих в…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы хотели бы поблагодарить Филиппа Уоррен для нее вид помощи.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| DMEM | Invitrogen | 41966-029 | ||
| HBSS | Invitrogen | 14170-088 | ||
| FCS | Invitrogen | 10091-148 | ||
| PSF | Invitrogen | 15240-062 | ||
| BPE | Invitrogen | 13028-014 | ||
| Forskolin | Calbiochem | 344273 | ||
| Coverlips | VWR-International | 631-0149 | ||
| Coverlips(rectangle) | MENZEL-GLASER (Supplied by Thermo Scientifics) | BB022050A1 | ||
| Chamber slides | Nunc-LabTek | 177380 | ||
| 4 well plates, 6 well plates | Nunc | 4 well plates 6 well plates |
||
| rat p75 antibody | Millipore, Temecula,California | MAB365 | ||
| GFAP antibody | Dako | Z0334 | ||
| Secondary antibodies (Alexa-conjugated) | Invitrogen | A-11004 A-11034 |
Goat anti mouse 568 Goat anti Rabbit 488 |
|
| Secondary biotinylated | Vector | Goat anti mouse | ||
| DAB tablets | Sigma-aldrich | D4418 | ||
| ABC elite kit | Vector | PK-6100 | ||
| Fine Forceps | FST | 11295-10 | ||
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6168 | ||
| Fluorosave | Calbiochem | 345789 |
References
- Assouline, J. G. Rat astrocytes and Schwann cells in culture synthesize nerve growth factor-like neurite-promoting factors. Brain Res. 428, 103-118 (1987).
- Taylor, J. S., Bampton, E. T. Factors secreted by Schwann cells stimulate the regeneration of neonatal retinal ganglion cells. J Anat. 204, 25-31 (2004).
- Reichardt, L. F. Integrins and cell adhesion molecules: neuronal receptors that regulate axon growth on extracellular matrices and cell surfaces. Dev Neurosci. 11, 332-347 (1989).
- Chiu, A. Y., Monteros, ., Espinosa de los, A., Cole, R. A., Loera, S., de Vellis, J. Laminin and s-laminin are produced and released by astrocytes, Schwann cells, and schwannomas in culture. Glia. 4, 11-24 (1991).
- Blakemore, W. F. Remyelination of CNS axons by Schwann cells transplanted from the sciatic nerve. Nature. 266, 68-69 (1977).
- Andrews, M. R., Stelzner, D. J. Evaluation of olfactory ensheathing and schwann cells after implantation into a dorsal injury of adult rat spinal cord. J Neurotrauma. 24, 1773-1792 (2007).
- Iwashita, Y., Fawcett, J. W., Crang, A. J., Franklin, R. J., Blakemore, W. F. Schwann cells transplanted into normal and X-irradiated adult white matter do not migrate extensively and show poor long-term survival. Exp Neurol. 164, 292-302 (2000).
- Lakatos, A., Franklin, R. J., Barnett, S. C. Olfactory ensheathing cells and Schwann cells differ in their in vitro interactions with astrocytes. Glia. 32, 214-225 (2000).
- Lakatos, A., Barnett, S. C., Franklin, R. J. Olfactory ensheathing cells induce less host astrocyte response and chondroitin sulphate proteoglycan expression than Schwann cells following transplantation into adult CNS white matter. Exp Neurol. 184, 237-246 (2003).
- Ghirnikar, R. S., Eng, L. F. Astrocyte-Schwann cell interactions in culture. Glia. 11, 367-377 (1994).
- Ghirnikar, R. S., Eng, L. F. Chondroitin sulfate proteoglycan staining in astrocyte-Schwann cell co-cultures. Glia. 14, 145-152 (1995).
- Plant, G. W., Bates, M. L., Bunge, M. B. Inhibitory proteoglycan immunoreactivity is higher at the caudal than the rostral Schwann cell graft-transected spinal cord interface. Mol Cell Neurosci. 17, 471-487 (2001).
- Fishman, P. S., Nilaver, G., Kelly, J. P. Astrogliosis limits the integration of peripheral nerve grafts into the spinal cord. Brain Res. 277, 175-180 (1983).
- Fok-Seang, J., Mathews, G. A., ffrench-Constant, C., Trotter, J., Fawcett, J. W. Migration of oligodendrocyte precursors on astrocytes and meningeal cells. Dev Biol. 171, 1-15 (1995).
- Wilby, M. J. N-Cadherin inhibits Schwann cell migration on astrocytes. Mol Cell Neurosci. 14, 66-84 (1999).
- Grimpe, B. The role of proteoglycans in Schwann cell/astrocyte interactions and in regeneration failure at PNS/CNS interfaces. Mol Cell Neurosci. 28, 18-29 (2005).
- Afshari, F. T., Kwok, J. C., White, L., Fawcett, J. W. Schwann cell migration is integrin-dependent and inhibited by astrocyte-produced. Glia. , (2010).
- Santos-Silva, A. FGF/heparin differentially regulates Schwann cell and olfactory ensheathing cell interactions with astrocytes: a role in astrocytosis. J Neurosci. 27, 7154-7167 (2007).
- Afshari, F. T., Kwok, J. C., Fawcett, J. W. Astrocyte-produced ephrins inhibit schwann cell migration via VAV2 signaling. J Neurosci. 30, 4246-4255 (2007).
