Large Scale Zebrafish-Based In vivo Småmolekylära skärm

Summary

Zebrafisk har framträtt som ett kraftfullt<em> In vivo</em> Plattform för fenotyp-baserade läkemedlet skärmar och kemiska genetisk analys. Här visar vi en enkel, praktisk metod för storskalig screening av små molekyler med hjälp av zebrafisk embryon.

Abstract

Med tanke på deras lilla embryo storlek, snabb utveckling, öppenhet, fruktsamhet, och många molekylära, morfologiska och fysiologiska likheter med däggdjur, har zebrafisk framträtt som ett kraftfullt<em> In vivo</em> Plattform för fenotyp-baserade läkemedlet skärmar och kemiska genetisk analys. Här visar vi en enkel, praktisk metod för storskalig screening av små molekyler med hjälp av zebrafisk embryon.

Protocol

1) Zebrafish insamling av ägg På eftermiddagen före dagen för den kemiska skärmen, ställa in 10 till 20 stridsvagnar zebrafisk avel. Fyll varje tank med vatten från vattenbruk systemet. Använda en fisk nät, överföring en vuxen hane och en till två tikar vuxen att innerbehållare i varje avel tank. Separera hanar och honor från varandra med en avdelare. Märk burar och lägga ett lock över dem. På morgonen av skärmen, ta bort avdelare från avel tankar och låta zebrafisk att para sig…

Discussion

När du planerar en zebrafisk-baserade kemiska skärmen, måste särskild uppmärksamhet ägnas åt den robusthet fenotyp i fråga och bakgrunden graden av sådan fenotyp. Detta är särskilt viktigt för skärmar för kemisk förtrycker en inducerad fenotyp. Till exempel för en fenotyp på grund av värme-chock induktion av en transgen, reproducerbart förutsättning att inducerar fenotyp måste vara exakt kartläggas före start skärmen för att undvika oacceptabelt höga falska positiva priser. Med noggrann planeri…

Materials

1. Minimum of 20 pairs of adult zebrafish of desired genotype.
2. Fish nets, Breeding tanks, with removable inner container and dividers (Aquatic Habitats).
3. Petri dishes (10 cm).
4. Plastic tea strainer.
5. Wash bottle containg embryo water.
6. Disposable polyethylene transfer pipettes.
7. Polystyrene 96-well round-bottom assay plates (Corning COSTAR; Lowell, MA).
8. Glass Pasteur pipette (Fisher Scientific).
9. Manual pipette pump, 10 mL (Bel-Art Products, Pequannock, NJ).
10. E3 embryo medium: 5 mM NaCl, 0.17 mM KCl, 0.33 mM CaCl₂ , 0.33 mM MgSO₄ , containing 0.003% PTU (phenylthio-carbamide, Sigma; St. Louis, MO). PTU can be prepared as a 10x solution by dissolving 0.3-g PTU in 1 L of E3 embryo media. Solutions containing PTU should be protected from light by covering with aluminum foil.
11. 12-channel pipettes, 2-20 μL (Eppendorf).
12. 12-channel pipettes, 3-300 μL (Eppendorf).
13. Disposable polystyrene pipette basin, 50 mL (Fisher Scientific).
14. Small molecule library of structurally diverse compounds arrayed in a 96-wll format at 10 mM stock in DMSO. Each master plate is aliquoted into 96-well polypropylene storage plates (Corning), and stored at -80°C until use.
15. Aluminum sealing tape for 96-well plates (Nunc, Rochester, NY).
16. DMSO (Sigma, St. Louis, MO).
17. Basic incubator, 28.5°C (Fisher Scientific).
18. Stereomicroscope with transmitted light base (Leica Microsystems, Bannockburn, IL).