Подготовка нейронных культур от Midgastrula этапе эмбрионы дрозофилы

Summary

Это видео демонстрирует подготовки первичных нейронов культур от midgastrula стадии эмбриона дрозофилы. Просмотров живых культур показывают клетки через 1 час после покрытия и дифференцированных нейронов после 2 дней роста бикарбоната основе определенной среде. Нейроны являются электрически возбудимыми и формы синаптических связей.

Abstract

Это видео показывает, порядок внесения первичных нейронов культур от midgastrula стадии эмбриона дрозофилы. Методы сбора эмбрионов и их dechorionation использования отбеливателя демонстрируются. Использование стеклянной пипетки придает трубке всасывания рот, мы проиллюстрируем удаление всех клетках одного из эмбрионов. Метод диспергирования клетки от каждого embyro в небольшой (5 л) каплю среды на немелованной стекло покровное демонстрируется. Вид через микроскоп на 1 час после покрытия иллюстрирует предпочтительный плотность клеток. Большинство клеток, которые выживают при выращивании в определенной среде являются нейробластов, которые делят один или несколько раз в культуре, прежде чем предоставлять neuritic процессов 12-24 часов. Вид через микроскоп иллюстрирует уровень аксонов и ветвление ожидается в здоровую культуру в 2-х дней в лабораторных условиях. Культур выращивают в простой бикарбонат основан определенной среде, в 5% CO ₂ инкубаторе при 22-24 ° С. Neuritic процессов продолжать разрабатывать в течение первой недели в культуре и, когда они делают контакт с нейритов из соседних клетках они часто образуют функциональные синаптических связей. Нейроны в этих культурах выразить напряжения закрытого натрия, кальция и калия каналов и являются электрически возбудимыми. Эта культура система полезна для изучения молекулярно-генетических и экологических факторов, которые регулируют дифференциацию нейронов, возбудимость, и формирование синапса / функцию.

Protocol

И. дрозофилы эмбрионов коллекции Подготовка пластин сбора яиц Отварите 200 мл дН 2 O с 8 г агар Остудить до 50 ° C Добавить 2 мл этанола и 2 мл уксусной кислоты Налейте в 35 мм пластиковые чашки Петри, топы Охладить и хранить в воздухе трудный контейнер при т…

Discussion

В культурах Drosophila приготовленные из эмбрионов midgastrula этапе нейроны возникают из нейробластов предшественников, многие из которых делят до дифференциации в пробирке. Эта система обеспечивает, таким образом уникальные возможности для исследования генетических и экологических факторов, важных в ?…

Materials

Material Name	Type	Company	Catalogue Number	Comment
Drosophila melanogaster	Animal			Fruit flies
Transferrin	Reagent	Sigma	T-1147	100x Stock: 10 mg/ml in water. Filter through 0.2 um syringe filter (cellulose acetate). Store in 220 ul aliquots (for 20 ml DMEM) at -20C.
Insulin		Sigma	I-6634	200x Stock: 10 mg/ml in 0.05N HCl. Filter through 0.2 um syringe filter (cellulose acetate). Store in 120 ul aliquots (for 20 ml DMEM) at -20C.
Putrescine		Sigma	P-5780	100x Stock: 10 mM in ddH2O. Filter through 0.2 um syringe filter (cellulose acetate). Store in 220 ul aliquots (for 20 ml DMEM) at -20 C
Selenium		Sigma	S-5261	100x Stock: 3 uM in ddH2O. Put 0.0051 g Selenium in a 15 ml tube labeled A (3 mM stock). Add 10 ml of sterile water. Take 10 ul from Tube A to Tube B with 10 ml ddH2O (3 uM stock). Filter Tube B through 0.2 um syringe filter (cellulose acetate). Store in 220 ul aliquots (for 20 ml DMEM) at -20C
Progesterone		Sigma	P-6149	100x Stock: 2 ug/ml 1. Add 1ml of 100% EtOH to 0.001 g Progesterone bottle 2. Add 49 ml ddH2O 3. Transfer 1 ml of this to second tube with 9 ml ddH2O 4. Filter through 0.2 um syringe filter (cellulose acetate) 5. Store in 220 ul aliquots (for 20 ml DMEM) at -20C
DDM1	Medium			To 10 mls of DMEM add from stocks: 100 ul Transferrin, 100 ul Putrescine, 100 ul Selenium, 100 ul Progesterone, 50 ul Insulin
Petri dishes
Cover-slips		Bellco Biological Glassware	1943-00012	Low lead glass, autoclaved.
Paper filter		Whatman	#1
10cc syringe	Tool

The cultures made in this media must be maintained in a 5% CO2 incubator at about 22-24°C. We use a standard mammalian tissue culture incubator placed in a cold room and heated to 23°C. Always used autoclaved filtered water and make in containers that are reserved for media and supplements only. Never put a pH meter or stir bar used for other purposes in media.