96 microtiter ובכן פלייט מבוססי שיטה ליצירת ניטור ובדיקה של רגישות נגד פטריות קנדידה אלביקנס Biofilms
Summary
אנו מתארים שיטה פשוטה, מהירה וחזקה ליצירת<em> קנדידה אלביקנס</em> Biofilms באמצעות 96 צלחות microtiter היטב השירות שלה בבדיקת רגישות פטריות של תאים בתוך biofilms.
Abstract
קנדידה אלביקנס נשאר הגורם השכיח ביותר של זיהומים פטרייתיים האוכלוסייה המתרחבת של חולים נפרץ קנדידה עכשיו את הזיהום השלישי בשכיחותו בבתי חולים בארה"ב. ביטויים שונים של קנדידה המשויכים היווצרות biofilm, הן רקמות המארח ו / או מכשירים רפואיים (כלומר צנתרים). היווצרות biofilm נושאת השלכות קליניות שליליות, כמו תאים בתוך biofilms מוגנים מפני תגובות מארח החיסונית מפעולה של antifungals. פיתחנו מודל במבחנה פשוטה, מהירה וחזקה ליצירת ג biofilms אלביקנס באמצעות 96 היטב microtiter צלחות, אשר יכול לשמש גם עבור בדיקות רגישות biofilm נגד פטריות. Readout של assay זה colorimetric, המבוססת על הפחתת XTT (מלח tetrazolium) על ידי תאים פעילים מבחינה מטבולית biofilm פטרייתי. ניסוי טיפוסי לוקח כ 24 שעות ליצירת biofilm, עם 24 שעות נוספות לצורך בדיקות רגישות נגד פטריות. בגלל הפשטות שלה, את השימוש בחומרים במעבדה זמין בדרך כלל ציוד, טכניקה זו democratizes מחקר biofilm מייצג צעד חשוב לקראת סטנדרטיזציה של בדיקות רגישות של פטריות biofilms פטרייתי.
Protocol
Discussion
כאן אנו מתארים פשוט, מהיר, חסכוני מאוד לשחזור 96 microtiter גם צלחת מודל להקמת biofilms קנדידה בשילוב עם שיטת colorimetric אשר מודד את הפעילות המטבולית של תאים בתוך biofilm באמצעות XTT. 96 זה microtiter גם צלחת מודל להקמת biofilm פותחה במקור עבור ג אלביקנס אך יכול לשמש אחרים קנדידה spp. …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Biofilm הקשורות לעבודה במעבדה ממומנת על ידי מענק ממוספרים R21DE017294 ו R21AI080930 מהמכון הלאומי למחקר דנטלי & Craniofacial לבין המכון הלאומי לאלרגיה ומחלות זיהומיות (JLL ל-R.). התוכן הוא באחריות הבלעדית של הכותבים ולא בהכרח מייצגים את הדעות הרשמיות של NIDCR, את NIAID או NIH.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Sabouraud-dextrose agar | Becton Dickinson | 211584 | To prepare plates for fresh subcultures of fungal isolates | |
| YPD: Yeast peptone dextrose | US Biological | Y2076 | Medium for propagation of overnight liquid cultures | |
| RPMI-1640 without sodium bicarbonate supplemented with L-glutamine | Cellgro | 50-020-PB | Liquid medium for biofilm formation | |
| Morpholinepropanesulfonic acid (MOPS) | Fisher | BP308 | To buffer RPMI 1640 | |
| Phosphate buffered saline, PBS | Sigma | P4417 | Buffer for washes | |
| XTT sodium salt | Sigma | X4251 | See above for preparation instructions | |
| Ringer’s lactate | Hospira | NDC0409-7953-09 | For preparation of XTT solution | |
| Menadione | Sigma | M5625 | Caution: hazardous by skin contact, inhalation or ingestion | |
| Petri dishes | Fisher | 08-757-12 | ||
| 15 ml conical centrifuge tubes | Corning | 430790 | ||
| 50 ml conical centrifuge tubes | Corning | 430828 | ||
| 96 well microtiter plates: Polystyrene, flat-bottomed, tissue culture treated | Corning | 3595 | ||
| Multichannel pipette and tips | Eppendorf | |||
| Incubator | Any | |||
| Microtiter plate reader | Any |
References
- Bachmann, S. P. In vitro activity of caspofungin against Candida albicans biofilms. Antimicrob Agents Chemother. 46, 3591-3596 (2002).
- Hawser, S. P., Norris, H., Jessup, C. J., Ghannoum, M. A. Comparison of a 2,3-bis(2-methoxy-4-nitro-5-sulfophenyl)-5-[(phenylamino)carbonyl]-2H-t etrazolium hydroxide (XTT) colorimetric method with the standardized National Committee for Clinical Laboratory Standards method of testing clinical yeast isolates for susceptibility to antifungal agents. J Clin Microbiol. 36, 1450-1452 (1998).
- Kuhn, D. M., Balkis, M., Chandra, J., Mukherjee, P. K., Ghannoum, M. A. Uses and limitations of the XTT assay in studies of Candida growth and metabolism. J Clin Microbiol. 41, 506-508 (2003).
- Kuhn, D. M., George, T., Chandra, J., Mukherjee, P. K., Ghannoum, M. A. Antifungal susceptibility of Candida biofilms: Unique efficacy of amphotericin B lipid formulations and echinocandins. Antimicrob. Agents Chemother. 46, 1773-1780 (2002).
- Nobile, C. J., Mitchell, A. P. C. albicans transcription factor Bcr1p: a regulator of cell-surface genes and biofilm formation. Current Biol. 15, 1150-1155 (2005).
- Ramage, G., Saville, S. P., Thomas, D. P., Lopez-Ribot, J. L. Candida biofilms: an update. Eukaryot Cell. 4, 633-638 (2005).
- Ramage, G., Vande Walle, K., Wickes, B. L., p, B. L., Lopez-Ribot, J. L. Standardized method for in vitro antifungal susceptibility testing of Candida albicans biofilms. Antimicrob Agents Chemother. 45, 2475-2479 (2001).
- Bachmann, S. P. Antifungal combinations against Candida albicans biofilms in vitro. Antimicrob Agents Chemother. 47, 3657-3659 (2003).
- Ramage, G., VandeWalle, K., Bachmann, S. P., Wickes, B. L., Lopez-Ribot, J. L. In vitro pharmacodynamic properties of three antifungal agents against preformed Candida albicans biofilms determined by time-kill studies. Antimicrob Agents Chemother. 46, 3634-3636 (2002).
- Ramage, G., VandeWalle, K., Wickes, B. L., López-Ribot, J. L. Characteristics of biofilm formation by Candida albicans. Rev. Iberoam. Micol. 18, 163-170 (2001).
- Tellier, R., Krajden, M., Grigoriew, G. A., Campbell, I. Innovative endpoint determination system for antifungal susceptibility testing of yeasts. Antimicrob Agents Chemother. 36, 1619-1625 (1992).
- Nett, J., Andes, D. Candida albicans biofilm development, modeling a host-pathogen interaction. Curr Opin Microbiol. 9, 340-345 (2006).
