の巨大線維経路からの電気生理学的記録 D.キイロ</em

Summary

ジャイアントファイバシステムでは、成人の単純な神経回路です。<em>キイロショウジョウバエ</em>フライの最大のニューロンを含む。私たちは、ジャイアントファイバ介在の直接の刺激後に背側縦（DLM）とtergotrochanteral（TTM）の筋肉に後シナプス電位を記録することによって、この経路を介してシナプス伝達を監視するためのプロトコルについて説明します。

Abstract

ときに大人を驚かせたD.キイロは空中にジャンプし、離れて飛んで反応する。 D.を含む多くの脊椎動物種、でキイロ 、"エスケープ"（または"驚愕"）成人段階で応答が多成分の神経回路によって媒介されるには、ジャイアントファイバーシステム（GFS）と呼ばれる。ニューロン、彼らの独特の形態とシンプルな接続性の比較大きなサイズは、GFS神経回路を研究するための魅力的なモデルシステムにします。 GFSの経路は、その軸索は子宮頸部の結合を介して胸部神経節への正中線に沿って脳から降りるtwo左右対称の巨大な繊維（GF）介在ニューロンで構成されています。腹側神経節tergotrochanteral筋肉を駆動する同側motorneuron 1）大規模な内側デンドライト（TTMn）（TTM）、mesothoracic大腿骨/足の主な伸筋とGFSのフォームは、電気化学的シナプスのmesothoracic神経分節（T2）で、および2）対側には、末梢背側縦筋（DLMS）、翼圧子のmotorneurons（DLMns）とターン形態の化学物質（コリン作動性）シナプス介在ニューロン（PSI）をsynapsing。彼らは翼に直接接続されるのではなく、移動 – dorsovental筋肉（DVMs）への神経経路（複数可）、翼エレベーターは、まだ（DLMSとDVMsが間接飛翔筋と共同で知られて働いたされていない歪曲近くの胸部キューティクルによって間接的に翼）（キングとワイマン、1980;。Allenら 、2006）。 DLMSのジ – シナプス活性化（PSIを介して）はTTMSが最初に大腿骨を延長して推進することができますTTMの単シナプス活性化（〜0.5 ms）の相対的なこれらの筋肉の収縮のタイミングで小さいながらも重要な遅延を引き起こす地面を飛んでいく。順番に相互に飛行の間、DVMsをストレッチアクティブストレッチアクティブDLMS同時にTTMS。 GFの経路は、脳に超えたしきい値電気刺激（ここで説明する）によって直接感覚（例："空気パフ"または"ライトオフ"）刺激を適用することによって間接的に活性化、またはすることができます。 TTMnsとDLMnsはまだ正体不明の、感覚入力として、他の持っていないものの、どちらの場合でも、活動電位は、単独でGFS、PSIS、とTTM / DLM運動ニューロンを介してTTMSとDLMSに達する。 "遅延の応答"（刺激と筋肉の脱分極間の時間）とを測定（高周波の刺激の一定の数に成功したレスポンスの数）"高頻度の刺激に続くのは、"再現性と定量機能状態を評価する方法を提供します中央のシナプス（GF – TTMn、GF – PSI、PSI – DLMn）と化学の両方を含むGFS成分、（グルタミン酸）の神​​経筋接合部（TTMn – TTMとDLMn – DLM）。それは中央のシナプス形成に関与する遺伝子を同定し、中枢神経系機能を評価するために使用されています。

Protocol

1。機器と材料これらの実験は、刺激、刺激分離ユニット、二つの微小電極増幅器、データ収集システムおよびコレクションのソフトウェアを備えたコンピュータで構成される標準的な電気生理学のセットアップを使用してください。追加の機器は、ファラデーケージ、ブームスタンドに実体顕微鏡、除振テーブル、光源、および記録のプラットフォームが含まれています。 五マイクロマニピュレータが使用されます。他の3つのマイクロマニピュレータは2つだけ刺激電極と接地電極を配置するグロスコントロールを必要としながら二つのマイクロマニピュレーターは、記録電極を位置決めするための細かいコントロールを必要とする。 DLMの記録電極のためのマニピュレータは、準備の末尾に置かれます（実験者の左）とTTM記録電極のためのマニピュレータは、準備の実験と側面（やや実験者の左側にある）の間に配置されます。シミュレーションの電極を保持する2つのマイクロマニピュレーターは、準備の頭部（実験者の右側）に配置されます。接地電極用マイクロマニピュレータは、準備の遠い側に配置されています MΩ40から60の抵抗とガラスの記録電極を引いて、ワックスでサポートされている皿に平らに保存。刺激には、2つの電解（NaOH）をシャープにタングステン電極が使用されます。タングステン線、またはサード電解作製電極は接地として使用されます。刺激と接地電極が準備され、マイクロマニピュレータに取り付けられ、実験セッションの開始前とセッションの期間中に交換する必要はない。 2。 D.の準備キイロ お使いの機器が設定されたら、それはハエを準備する時間です。その上に氷を冷却することにより、またはCO 2を使用して、ハエを麻酔。 CO 2が使用されている場合には、ガスの影響のための十分な時間が（20分程度）の実験を開始する前に脱ぎ履きすることができます。 約45 °の角度で傾斜ソフトワックスのプラットフォームを含む皿に自分の足でゆっくりとハエを転送するために鉗子を使用してください。次の4つのステップは、（ただし、これらに近い）の録音機器から離れて解剖顕微鏡下で行われます。 次のステップは、ワックスでハエを確保することです。オリエントは、斜面上で、その前方に面した上にして、腹側を下に飛ぶ。細かいピンセットを使って、ペアで、足を外側に拡張し、ワックスにそれらを押してください。 背縦走筋、またはDLM、およびtergotrochanteral筋肉、またはTTM：から記録される筋肉の位置を把握しておきましょう。 DLMSの表皮下の結合部位は、胸部正中線と前背側（または剛毛）毛の間の領域に対応しています。 TTMの付着部位は上記、鼻翼が剛毛後部と前部の背側に位置しています。ワックスにして、翼がDLMまたはTTM繊維へのアクセスを妨害しないことを確認して外側の翼を持ち、"接着剤"。 鉗子の罰金ペアを使用して、外側に慎重に口吻を引いて、そしてワックスにそれを浸漬することによってそれを固定します。これは、口吻が柔らかく、簡単にヘッドの他の部分から切り離されているので、いくつかの練習を必要とする重要なステップです。その場合、フライを破棄して最初からやり直す。目を通して刺激電極を挿入するときにこの方法で頭を保護するために障害が問題につながります。 3。電極を配置フライがワックスに固定されると、ファラデーケージ内部に配置されている実体顕微鏡の下に接続されたフライで皿を転送する。オリエントは、実験者の右にハエの頭で横飛び。 次のステップは、電極を挿入することです。地面と刺激電極を顕微鏡で見ることなく挿入することができます。良い記録が正確な串刺しの刑に依存している、それはマニピュレーターを扱う練習する良いアイデアですので。それらの適切な配置とそれに続くレコーディングを容易にするためにマイクロマニピュレータの助けを借りて、挿入部位の近くに電極をもたらす。 マイクロマニピュレータの調整ホイールを使って腹部の後端に接地電極を下ろします。脳内で鋭利なタングステン刺激電極を配置するには、それだけでハエの目の一つに触れるように一方の電極の先端の位置をマイクロマニピュレーターを使用してください。両電極は、単にそれぞれの目の外側に触れているので、他のと同じ操作を行います。その後、電極を押し、順番に、それぞれの目を通して、電極の先端が頭部カプセルの背面（2〜3ミリメートル程度）に位置する脳に達するので。 正しく配置された電極は、ジャイアントファイバーシステムがアクティブになります。刺激電極が正しく配置されていることをテストするには、30から60までの短い（0.03ミリ）の刺激を適用する刺激電極、および飛行/脚部筋肉の翼とけいれんの動きのための外観全体のV' 次のステップは、ハミルトンや熱引っ張らプラスチックシリンジを使用して3M KClをガラス微小電極を埋戻し、及び微制御マニピュレーターにそれらを置くことです。適切に挿入された微小電極は、実験のいくつかのラウンドに使用することができます。 最初の記録電極は、DLMの繊維に挿入されます。 two左右対称DLMSがありますが、それぞれは6つの個々の筋線維で構成されています。録音は、6つの繊維のいずれかから行うことができますが、最も一般的に使用さDLM繊維胸部キューティクルの背側を介してそれらの良好なアクセス性のために45aと45bは、両方の繊維が同じmotorneuronによって支配されているという事実である。 お客様から最も遠い側にマイクロマニピュレーターを用いて、DLM繊維45Aまたはbに記録電極を挿入するプラットフォームの傾斜は、DLM電極の浸透を助ける〜60から90 °の角度、で背側クチクラを入力することができます。オシロスコープモードでソフトウェアを使用し、胸部に記録電極を挿入しながら、コンピュータのモニターを見ながら行ってください。電極は、筋肉を入力したときのベースラインはほぼゼロまたは負の値に低下します。あなたが筋肉の反応を観察できるかどうかを確認するために、単一の刺激とテスト。 あなたに一番近いTTMに他の記録電極を挿入します。この電極は、筋肉の付着部位の位置のために、あなたの前に、横方向に挿入されます。トレースは、電極が筋肉であることを示すと、単一の刺激でこれとテストをしながら、もう一度モニターを観察。 4。刺激と記録これで、脚と飛翔筋から脳と記録の応答を刺激開始する準備が整いました。 30 Vから始まると（コンピュータのモニタ上で観察されるように、すなわち筋収縮、および筋細胞の脱分極）が応答を観測するまで、60 Vに増加させる刺激電極間のショート（0.03ミリ）刺激を適用します。実験の残りの部分では、応答の閾値以上の電圧が50から10 Vに設定します。 応答の遅延を測定するには、各刺激の間に5秒間の残りの期間で、少なくとも5つの刺激を与える。 異なるレートで刺激の列車を提供することにより、"以下の周波数を"決定する。通常10刺激の10列車は、200Hzの（各刺激の間に5msの）と300Hzのは、（各刺激の間に3msの）、100Hzの（各刺激の間に10msの）で与えられる。刺激の各列車の間に2秒の休止期間を許可する。 5。結果：ジャイアント線維経路で、次の応答のレイテンシと周波数応答待ち時間は、脳の刺激と筋肉の脱分極までの時間です。この図は、単一刺激にDLMとTTMの応答待ち時間を比較します。 0.7 GF – DLM経路用GF – TTM経路用と1.3と1.7ミリから1.2ミリ秒の間のレイテンシは、健全な準備と適切な録音のテクニックを示している。待ち時間は、遺伝子型、遺伝的背景、温度と加齢とともに変化することができます。 図1（AおよびB）。脳に適用される単一の刺激に続くTTMSとDLMSから記録された応答を示す代表的なトレース。 ここに示されているように、TTMからの録音は、振幅と大きなDLM繊維からのものに比べてシナプス後電位（PSP）の形状の面でより多くの変動を示し、この増加の変動は、TTM筋線維のサイズが小さいためです。この可変性は、しかし、巨大なファイバーツーTTM経路の応答の待ち時間の値には影響しません。 図1（CおよびD）。TTMとDLMの両方のための4つの個別ハエからさらに"応答の待ち時間"のトレース。 TTMのトレースは、PSPの形状の変動を示すが、応答の遅延は影響を受けませんされます。 DLMのためにPSPの形状にあまりばらつきがある。 各刺激の周波数でのDLMとTTMの経路の両方に成功応答（10点満点）の割合を計算することによって100 Hz、200 Hzの、300 Hzで、"以下の周波数を"比較。 100 Hzで、TTMとDLMの両方が刺激1:1に従ってください。 100 Hzの上記の刺激の周波数では、DLMの応答は、2つの介在ニューロンの間の仲介の化学シナプスは、刺激間で回復するのに十分な時間がないため、障害の表示を開始します。 TTMの応答は、しかし、さらに300Hzのを超えて刺激と1:1のままである。 図2の録音を"以下の周波数"を示す代表的なトレース。 100Hzで、TTMSとDLMS両方がすべての10の刺激（左）に対応。 200Hzの時に、DLM応答は（アスタリスク）が失敗し始めます。 6。代表的な結果野生型短潜時応答は、（刺激電極が目に配置され、感覚受容器をバイパスし、直接GF回路が作動）遺伝子型、遺伝的背景、温度、年齢、およびGF – TTMの経路は0.7と1.2ミリ秒の間の範囲に依存し、 GF – DLM経路1.3 and1.7ミリ秒（Tanouyeとワイマン、1980;トーマスとワイマン、1984年、エンゲルと呉、1992;アレンやマーフィー、2007;フェランら、2008;。オーギュら 、未発表。） 。この非常に短いTTMの待ち時間は単シナプス経路の堅牢なGF – TTMn電気シナプスによるもので、長くDLM待ち時間が原因経路のdisynaptic性質だけでなく、化学シナプス（PSI – DLMn）の存在が原因で発生します。 GFの求心性神経の活性化と低強度の刺激を使用するか、視覚的な（"ライトオフ"）信号を提供することによって、どちらかが達成されているから中間とレイテンシの長い応答（> 3ミリ秒）の結果。 100HzでTTMとDLMの両方が刺激1:1に従ってください。 100HzのDLMの応答の上にPSIとDLMnsの間の化学シナプスが離れて10ミリ秒未満の刺激の間に回復するために十分な時間を持っていないので、障害を表示するために開始されます。 TTMの応答は、しかし、さらに300Hzの（;エンゲルと呉、1992;。Allenら、2007;。マルティネスら 、2007 Tanouyeとワイマン、1980）を超えて刺激と1:1のままになります。 GF – DLMのブランチの応答がない間、 ショウジョウバエのギャップジャンクションチャネル（"innexinを"）をコードするshakB遺伝子の突然変異は、、大幅にGF – TTM経路（〜1.5ミリ秒）の応答の待ち時間が増加（アレンやマーフィー、2007;フェランら 、2008）。変異体の応答が遅延効果が中断神経筋伝達によるものではないことを示す、直接胸神経節を刺激することによって復元することができます。高い周波数の刺激に従う能力はまた、野生型GF – DLMとGF – TTM経路は通常、それぞれ100 Hzと300 Hzの、1:1の比率で10刺激をフォローアップすることができる場所飛ぶと比較して、これらの変異体では低下している。これらの周波数はかなり持続飛行時の収縮筋（3-10 Hz）の（Hummonとコステロ、1989）によって受信された正常な刺激の周波数を超えていることに注意する必要があります。 GFSの出力の安定性を記述するために使用される別のパラメータには、"不応期"、または、まだ筋肉から2つの応答を生成するツイン刺激パルス間の最小時間です。耐火時間はTTMS 1-4の間にmsおよびDLMSのための7から15ミリ秒を変化させます。 Gorczycaとホール、1984; DLMSのための比較的長い不応期が比較的PSI – DLMnジャンクション（Tanouyeとワイマン、1980での化学シナプスを不安定なことになっているエンゲルと呉、1992;。Banerjeeさんら 、2004;アレンとGodenschwege、 2010）。

Discussion

いずれかの高品質の録音を取得しようとしたときに注意を払わなければならない最も重要なことの一つは、準備の適切な方向と健康です。理想的には、ハエはまだレコーディングセッションの終了時に生きていると電気刺激に応答してください。記録電極は、最も効率的に胸部外骨格を浸透させるには、フライは、電極と直角を形成するような方法で表面に接着する必要がある、必要な場合は、電極の挿入はの部分を除去することによって促進することができます。 DLM飛翔筋を（このステップは、ガラス電極の先端が破損することが困難にするという追加の利点を提供しています）公開するため、メスタングステンと背側胸部キューティクル。また、介護がsubcuticularlyあるDLMSとTTMS介して電極を押ししないように注意する必要があります。ハエの頭がよく適切に脳内に挿入される刺激電極を可能にするために、それらは、記録セッション中に引き出されるのを防ぐためにセキュリティで保護する必要があります。

その大きさとよく説明した形態に起因する、GFSは、 ショウジョウバエで最もアクセス神経経路のいずれかを表します。小さ ​​な分子量のトレーサーの染料に電気シナプスの透過性は、電気的に結合ニューロンの可視化を可能にし、いくつかの利用可能なGAL4ラインは、セルまたはセルのグループ（Jacobs ら 、2000のサブセットの遺伝子発現レベルを操作することが可能に。。アレンら 、2006） ショウジョウバエ GFS神経可塑性を研究するための便利なモデルシステム（エンゲルと呉作る上記の利点が、そのような習慣性、自然回復と脱馴化などの回路の表示プロパティの両方求心性と胸部のコンポーネントに加えて、 1996年）。

Materials

NAME	COMPANY	CAT. #	COMMENTS
S48 Square Pulse Stimulator	Grass Instruments		http://www.grasstechnologies.com/
Stimulation unit	Grass Instruments		http://www.grasstechnologies.com/
SIU5 RF Transformer Isolation Unit	Grass Instruments		http://www.grasstechnologies.com/
5A two-channel intracellular Microelectrode Amplifier	Getting Instruments		http://www.gettinginstruments.com/
Digidata 1440A data acquisition system	Molecular Devices		http://www.moleculardevices.com/
Analogue-digital Digidata 1320 and Axoscope 9.0 software	Molecular Devices		http://www.moleculardevices.com/
Recording platform with manual micromanipulators	Narishige, Sutter Ins., World Precision Ins.		http://narishige-group.com/ http://www.sutter.com/index.html http://www.wpi-europe.com/en/
Light source	Fostec		http://www.nuhsbaum.com/FOSTEC.htm
Wild M5 stereomicroscope	Wild Heerbrugg		http://www.wild-heerbrugg.com/
Vibration isolation table	TMC		http://www.techmfg.com/
Borosilicate tubing for microelectrodes	Sutter Instrument		http://www.sutter.com/index.html
P-95 Micropipette puller	Sutter Instrument		http://www.sutter.com/index.html
Microfil 34 gauge, 67 mm (electrode filler)	World Precision Instruments	MF34G-5	http://www.wpi-europe.com/en/
Microdissection tools (forceps,…)	Fine Science Tools		www.finescience.com
Dissecting (stereo) microscope	Leica		http://www.leica-microsystems.com/
Faraday cage	Unknown manufacturer

Other: plastic syringes, tungsten earth wire and NaOH-sharpened tungsten electrodes, KCl, wax platform, a PC with monitor…