Summary
Il sistema di fibra Gigante è un semplice circuito neuronale di adulti
Abstract
Quando spaventato adulto D. melanogaster reagire saltando in aria e volare via. In molte specie di invertebrati, tra cui D. melanogaster, la "fuga" (o "spaventare") risposta durante la fase adulta è mediato dal multi-componente del circuito neuronale chiamato Sistema fibra Gigante (GFS). La dimensione comparativa di grandi dimensioni dei neuroni, la loro particolare morfologia e connettività semplice rendere il modello GFS un sistema interessante per lo studio di circuiti neuronali. Il percorso GFS è composto da due simmetria bilaterale gigante Fibra (GF) interneuroni cui assoni scendono dal cervello lungo la linea mediana nel ganglio toracico tramite il connettivo cervicale. Nel neuromere mesothoracic (T2) dei gangli ventrali forma GF elettro-chimica delle sinapsi con 1) il dendrite grande mediale della motorneuron ipsilaterale (TTMn) che aziona il muscolo tergotrochanteral (TTM), l'estensore principale per il femore mesothoracic / gamba , e 2) controlaterale interneurone perifericamente sinapsi (PSI), che a loro volta forme chimiche (colinergici) sinapsi con i motoneuroni (DLMns) dei muscoli dorsali longitudinali (DLMS), l'ala depressori. Il percorso neuronale (s) ai muscoli dorsovental (DVMS), gli ascensori ala, non è stato ancora elaborato (il DLMS e DVMS sono noti congiuntamente come i muscoli di volo indiretto - che non sono collegati direttamente alle ali, ma piuttosto spostare l' ali indirettamente distorcendo la cuticola vicina toracica) (King e Wyman, 1980;. Allen et al, 2006). Il di-sinaptica attivazione del DLMS (via PSI) causa un ritardo piccolo ma importante nel momento della contrazione di questi muscoli relativi alla attivazione monosinaptico di TTM (~ 0,5 ms), permettendo di estendere TTMs prima del femore e spingere il volare da terra. Il TTMs contemporaneamente stiro-attivare il DLMS che a sua volta tratto reciprocamente-attivare il DVMS per tutta la durata del volo. Il percorso GF può essere attivato sia indirettamente applicando una sensoriale (ad esempio "air-puff" o "luci-off") stimolo, o direttamente da un sovra-soglia di stimolo elettrico al cervello (descritto qui). In entrambi i casi, un potenziale d'azione raggiunge il TTMs e DLMS solo attraverso il GF, SIPS, e TTM / DLM motoneuroni, anche se la TTMns e DLMns hanno altre, non ancora identificato, input sensoriali. Misura "risposta latenza" (il tempo che intercorre tra la stimolazione e la depolarizzazione del muscolo) e il "seguito alla stimolazione ad alta frequenza" (il numero di risposte efficaci a un certo numero di stimoli ad alta frequenza) fornisce un modo per valutare in modo riproducibile e quantitativamente lo stato funzionale dei componenti GFS, includendo sia le sinapsi centrale (GF-TTMn, GF-PSI, PSI-DLMn) e la chimica (glutamatergica) giunzioni neuromuscolari (TTMn-TTM e DLMn-DLM). È stato usato per identificare i geni coinvolti nella formazione di sinapsi centrali e per valutare la funzione del SNC.
Protocol
1. Attrezzature e materiali
- Questi esperimenti utilizzare una configurazione standard elettrofisiologia composto da uno stimolatore, una unità di isolamento stimolo, due amplificatori microelettrodo, un sistema di acquisizione dati e un computer con software di raccolta. Le apparecchiature aggiuntive comprendono una gabbia di Faraday, uno stereomicroscopio su un supporto braccio, un tavolo isolamento dalle vibrazioni, una fonte di luce, e una piattaforma di registrazione.
- Cinque micromanipolatori vengono utilizzati. Due micromanipolatori richiedono controlli bene per il posizionamento degli elettrodi di registrazione, mentre gli altri tre micromanipolatori richiedono solo controlli lordo per posizionare i due elettrodi di stimolazione e l'elettrodo di massa. Il micromanipolatore per l'elettrodo di registrazione DLM è posto alla fine della coda della preparazione (a sinistra di sperimentatore) e il micromanipolatore per l'elettrodo di registrazione TTM è posto tra lo sperimentatore e il lato della preparazione (leggermente a sinistra dello sperimentatore). I due micromanipolatori che conterrà gli elettrodi di simulazione sono posti a capo della preparazione (diritto di sperimentatore). Il micromanipolatore per l'elettrodo di terra è posto al lato opposto della preparazione
- Tirare microelettrodi registrazione di vetro con resistenze di 40-60 MΩ e memorizzare appartamento in un piatto sostenuto da cera. Per la stimolazione, due elettrodi di tungsteno elettroliticamente (NaOH) affilato vengono utilizzati. Un filo di tungsteno, o di un terzo elettrodo elettroliticamente fabbricato viene utilizzato come terreno. Gli elettrodi stimolanti e terra sono preparati e attaccato al micromanipolatori prima dell'inizio della sessione sperimentale e non deve essere sostituito per tutta la durata della sessione.
2. Preparazione del D. melanogaster
- Una volta che la vostra attrezzatura è impostato, è il momento di preparare le mosche. Anestetizzare le mosche da raffreddamento su di loro o utilizzando ghiaccio di CO 2. Se la CO 2 viene utilizzata, il tempo sufficiente (circa 20 minuti) per gli effetti del gas a svanire prima di iniziare l'esperimento.
- Usare pinze per trasferire le mosche con delicatezza per le zampe ad un piatto contenente una piattaforma di cera morbida inclinata con un angolo di circa 45 °. I prossimi quattro passi si fanno sotto un microscopio da dissezione lontano da (ma vicino a) l'apparecchio di controllo.
- Il passo successivo è quello di garantire al volo in cera. Orientare il lato ventrale volare verso il basso, con il suo anteriore rivolta verso l'alto sul pendio. Usando un paio di pinze fine, estendere le gambe verso l'esterno, a coppie, e spingerli nella cera.
- Familiarizzare con la posizione dei muscoli da registrare da: il muscolo dorsale longitudinale, o DLM, e il muscolo tergotrochanteral, o TTM. I siti attaccamento intradermica della DLMS corrispondono con la regione tra la linea mediana del torace e la dorsale anteriore setole (o setae). I siti attaccamento TTM si trovano dorsalmente del posteriore e anteriore sovra-alari setole. Fare in modo che le ali non ostruire l'accesso alle fibre DLM o TTM, tenere le ali verso l'esterno e 'colla' a la cera.
- Utilizzando un bel paio di pinze, tirare la proboscide verso l'esterno con attenzione, e fissarlo immergendolo nella cera. Questo è un passo fondamentale che richiede una certa pratica in quanto la proboscide è morbido ed è facilmente staccato dal resto della testa. Se ciò accade, scartare il volo e ricominciare. Il mancato per fissare la testa in questo modo porta a problemi durante l'inserimento degli elettrodi stimola attraverso gli occhi.
3. Posizionamento degli elettrodi
- Una volta che la mosca è ancorata alla cera, trasferire il piatto con la mosca allegato sotto lo stereomicroscopio, che si trova all'interno della gabbia di Faraday. Orientare il volo lateralmente con la testa della mosca a destra dello sperimentatore.
- Il passo successivo è quello di inserire gli elettrodi. Elettrodi di massa e stimolante può essere inserito senza guardare nel microscopio. Buone registrazioni si basano su palo preciso, quindi è una buona idea di praticare la manipolazione del micromanipolatori. Portare gli elettrodi vicino ai siti di inserimento con l'aiuto di micromanipolatori per facilitare la loro collocazione corretta e registrazioni successive.
- Abbassare l'elettrodo di terra nella estremità posteriore dell'addome con le ruote di regolazione del micromanipolatore. Per posizionare gli elettrodi di tungsteno affilato stimolante a livello cerebrale, utilizzare il micromanipolatore per posizionare la punta di uno degli elettrodi in modo che tocchi solo uno degli occhi di mosca. Fate lo stesso con l'altra in modo che entrambi gli elettrodi sono solo toccando l'esterno di ogni occhio. Quindi spingere gli elettrodi, a loro volta, attraverso ogni occhio così le punte degli elettrodi raggiungere il cervello situata nella parte posteriore della capsula testa (circa 2-3mm).
- Elettrodi posizionati correttamente si attiverà il sistema di Gigante fibra. Per verificare che gli elettrodi stimolanti sono posizionati correttamente, applicare un corto (0,03 ms) Stimolo di 30-60 V attraverso gli elettrodi stimolanti, e cercare il movimento delle ali e contrazioni del volo / gamba muscolare '
- Il passo successivo è quello di back-riempire il bicchiere con microelettrodi 3M KCl con un Hamilton o calore tirato siringa di plastica, e metterli nel fine controllo micromanipolatori. Microelettrodi inseriti correttamente può essere utilizzata per diversi round di esperimenti.
- L'elettrodo prima registrazione verrà inserito in una fibra DLM. Ci sono due DLMS simmetria bilaterale, ognuno è composto da sei singole fibre muscolari. Le registrazioni possono essere fatto da uno dei sei fibre, ma il più comunemente usati sono fibre DLM 45 bis e 45 ter per la loro buona accessibilità attraverso il lato dorsale della cuticola toracica, e il fatto che sia le fibre sono innervati dal motorneuron same .
- Utilizzando il micromanipolatore sul lato più lontano da te, inserire un elettrodo di registrazione in fibra DLM 45 bis o b. La pendenza della piattaforma consente l'elettrodo DLM per entrare nella cuticola dorsale ad un angolo di ~ 60-90 °, che aiuta la penetrazione. Utilizzare il software in modalità oscilloscopio e guardare il monitor del computer mentre l'inserimento di elettrodi di registrazione nel torace. Quando l'elettrodo è entrato un muscolo la linea di base scenderà quasi a zero o un valore negativo. Prova con un singolo stimolo per vedere se è possibile osservare la risposta del muscolo.
- Inserire l'altro elettrodo di registrazione nel TTM più vicino a voi. Questo elettrodo viene inserito lateralmente, di fronte a voi, a causa della posizione del sito di inserzione del muscolo. Anche in questo caso osservare il monitor mentre si fa questo e prova con un singolo stimolo una volta che la traccia indica l'elettrodo è nel muscolo.
4. Stimolazione e registrazione
- Ora siete pronti per iniziare a stimolare il cervello e le risposte registrazione dalla muscoli di gambe e di volo. Applicare una breve (0,03 ms) stimolo attraverso gli elettrodi stimolante a partire da 30 V e di aumentare a 60 V fino a quando si osserva una risposta (cioè una contrazione muscolare, e una depolarizzazione delle cellule muscolari come osservato sul monitor del computer). Per il resto l'esperimento, riportare la tensione V 5-10 al di sopra della soglia di risposta.
- Per misurare la latenza di risposta, dare almeno 5 stimoli singoli con un periodo di 5 secondo riposo tra ogni stimolo.
- Determinare la "frequenza di seguire" fornendo i treni di stimoli a velocità diverse. Tipicamente 10 treni su 10 stimoli sono date a 100 Hz (10 ms tra ogni stimolo), 200Hz (5 ms tra ogni stimolo) e 300Hz (3 ms tra ogni stimolo). Consentire un periodo di riposo di 2 secondi tra ogni treno di stimoli.
5. Risultati: latenze di risposta in frequenza e di seguito nella via fibra Gigante
- La latenza di risposta è il tempo che intercorre tra la stimolazione del cervello e depolarizzazione del muscolo. Questa cifra si confronta le latenze di risposta per DLM e TTM ad un singolo stimolo. Latenze tra 0,7 e 1,2 ms per il GF-TTM percorso e tra 1,3 e 1,7 ms per il GF-DLM percorso indicano una preparazione tecnica di registrazione sana e corretta. Le latenze può variare con genotipo, background genetico, la temperatura e l'età.
Figura 1 (A e B). Rappresentante tracce presentano risultati registrati dal TTMs e DLMS a seguito di un singolo stimolo applicato al cervello. - Come mostrato qui, registrazioni dal TTM mostrano una maggiore variabilità in termini di ampiezza e la forma del potenziale postsinaptico (PSP) rispetto a quelli delle fibre di DLM di grandi dimensioni; questa maggiore variabilità è dovuta alle piccole dimensioni delle fibre muscolari TTM. Questa variabilità, tuttavia, non influenza i valori di latenza di risposta per il gigante Fiber-to-TTM percorso.
Figura 1 (C e D). Aggiuntive 'latenza di risposta' tracce da 4 mosche individuale sia per il TTM e DLM. Nota TTM variabilità presentano tracce di forma PSP ma la latenza di risposta non è influenzato. Per DLM c'è meno variabilità di forma PSP.
- Confrontare la "frequenza di seguire" a 100 Hz, 200 Hz e 300 Hz calcolando la percentuale di risposte efficaci (su 10) sia per DLM e percorsi TTM ad ogni frequenza di stimolazione. A 100 Hz, sia TTM e DLM seguire le 01:01 stimoli. A frequenze di stimolazione superiori a 100 Hz, le risposte DLM iniziano a mostrare fallimenti perché la sinapsi chimica intermediario tra due interneuroni non ha tempo sufficiente per recuperare tra stimoli. Le risposte TTM, tuttavia, restano 1:1 con stimoli anche oltre 300Hz.
Figura 2. Tracce Rappresentante mostra la "frequenza di seguire" le registrazioni. A 100Hz, sia TTMs e DLMS rispondere a tutti i 10 stimoli (a sinistra). A 200Hz, le risposte DLM iniziare a fallire (asterisco).
6. Rappresentante Risultati
Wild type breve latenza risposte (elettrodi stimolati sono posti negli occhi, bypassando i recettori sensoriali e innescando il circuito GF direttamente) dipendono da genotipo, background genetico, la temperatura e l'età, e la gamma tra 0,7 e 1,2 ms per il GF-TTM percorso e and1.7 1,3 ms per il GF-DLM percorso (Tanouye e Wyman, 1980; Thomas e Wyman, 1984; Engel e Wu, 1992; Allen e Murphey, 2007; Phelan et al, 2008;. Agostino et al, non pubblicata.) . Questa latenza TTM molto brevi è dovuta alla robusta GF-TTMn sinapsi elettrochimica del percorso monosinaptico e la latenza più DLM si verifica a causa della natura disynaptic della via così come la presenza di una sinapsi chimica (PSI-DLMn). Intermedia e lunga latenza delle risposte (> 3 ms) derivare dalla attivazione delle afferenze GF e sono realizzati mediante l'utilizzo di una stimolazione minore intensità o fornire un controllo visivo ("light-off") del segnale. A 100Hz sia TTM e DLM dovrebbe seguire gli stimoli 1:1. Sopra 100Hz risposte DLM inizierà a mostrare fallimenti come la sinapsi chimica tra PSI e il DLMns non ha tempo sufficiente per recuperare tra stimoli meno di 10ms a parte. Risposte TTM, comunque, rimarrà 1:1 con stimoli anche al di là 300Hz (Tanouye e Wyman, 1980; Engel e Wu, 1992;. Allen et al, 2007;. Martinez et al, 2007). Le mutazioni nel gene shakB, che codifica per una Drosophila divario di giunzione canale ("innexin"), un aumento significativo della latenza di risposta del GF-TTM percorso (~ 1,5 ms) mentre il GF-DLM ramo non risponde (Allen e Murphey, 2007; Phelan et al., 2008). La risposta mutante può essere ripristinata attraverso la stimolazione dei gangli toracici direttamente, a dimostrazione che l'effetto ritardato non è dovuto a interrotto la trasmissione neuromuscolare. La capacità di seguire la stimolazione ad alta frequenza è alterata in questi mutanti rispetto ai wild-type vola dove il GF-DLM e GF-TTM percorsi sono generalmente in grado di seguire 10 stimoli con rapporto 1:1 fino a 100 Hz e 300 Hz rispettivamente. E 'importante notare che queste frequenze sono notevolmente al di sopra frequenze di stimolazione normale ricevuto dal contrazione dei muscoli durante il volo prolungato (3-10 Hz) (Hummon e Costello, 1989).
Un altro parametro utilizzato per descrivere la stabilità delle uscite GFS è il "periodo refrattario", ovvero il tempo minimo tra gli impulsi stimolo gemello che produce ancora due risposte dal muscolo. Il tempo refrattario varia tra i 1-4 ms per TTMs ei 7-15 ms per DLMS. Il periodo relativamente lungo refrattari per DLMS è dovuto alla relativamente labile sinapsi chimica al PSI-DLMn giunzione (Tanouye e Wyman, 1980; Gorczyca e Hall, 1984; Engel e Wu, 1992; Banerjee et al, 2004;. Allen e Godenschwege, 2010).
Discussion
Una delle cose più importanti si deve prestare attenzione quando si cerca di ottenere registrazioni di alta qualità è il giusto orientamento e la salute della preparazione. Idealmente, il volo dovrebbe essere ancora vivo alla fine della sessione di registrazione e reattivo agli stimoli elettrici. Per gli elettrodi di registrazione per penetrare in modo più efficiente l'esoscheletro toracica, il volo deve essere incollata alla superficie in modo da formare un angolo retto con gli elettrodi, se necessario, l'inserimento di elettrodi può essere facilitato dalla rimozione di una porzione del dorsal cuticola thoracic con uno scalpello tungsteno esponendo così le muscle DLM volo (questo passo offre un ulteriore vantaggio di rendere più difficile per le punte degli elettrodi di vetro per rottura). Inoltre, la cura deve essere presa per evitare di spingere gli elettrodi attraverso i DLMS subcuticularly trova e TTMs. La testa della mosca deve essere ben assicurato per consentire la elettrodi stimolanti per essere adeguatamente inserito nel cervello e di impedire loro di essere tirato fuori durante la sessione di registrazione.
Grazie alle sue dimensioni e ben descritta la morfologia, la GFS rappresenta uno dei percorsi più accessibili neuronali in Drosophila. La permeabilità delle sinapsi elettriche ai coloranti piccolo peso molecolare tracciante permette la visualizzazione dei neuroni elettricamente accoppiati, e diverse linee GAL4 disponibili consentono di manipolare i livelli di espressione genica in un sottogruppo di cellule o gruppi di cellule (Jacobs et al, 2000;. Allen et al., 2006) In aggiunta ai vantaggi di cui sopra, sia i componenti afferenti ed toracica di proprietà di visualizzazione del circuito, come abitudine, il recupero spontaneo e dishabituation, rendendo la GFS Drosophila un sistema modello ideale per studiare la plasticità neuronale (Engel e Wu, 1996).
Disclosures
Nessun conflitto di interessi dichiarati.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato supportato da una Wellcome Trust borsa di LP
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| S48 Square Pulse Stimulator | Grass Technologies | ||
| Stimulation unit | Grass Technologies | ||
| SIU5 RF Transformer Isolation Unit | Grass Technologies | ||
| 5A two-channel intracellular Micr–lectrode Amplifier | Getting Instruments, Inc. | ||
| Digidata 1440A data acquisition system | Molecular Devices | ||
| Analogue-digital Digidata 1320 and Axoscope 9.0 software | Molecular Devices | ||
| Recording platform with manual micromanipulators | Narishige International | ||
| Light source | Fostec | ||
| Wild M5 stereomicroscope | Wild Heerbrugg | ||
| Vibration isolation table | TMC | ||
| Borosilicate tubing for micr–lectrodes | Sutter Instrument Co. | ||
| P-95 Micropipette puller | Sutter Instrument Co. | ||
| Microfil 34 gauge, 67 mm (electrode filler) | World Precision Instruments, Inc. | MF34G-5 | |
| Microdissection tools (forceps,…) | Fine Science Tools | ||
| Dissecting (stereo) microscope | Leica Microsystems | ||
| Faraday cage | Unknown | ||
| Other: plastic syringes, tungsten earth wire and NaOH-sharpened tungsten electrodes, KCl, wax platform, a PC with monitor... | |||
References
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