消化管運動のモニター（GIMM）

Summary

消化管運動のモニター（GIMM）によるモルモット遠位結腸の大腸運動の評価は、定量的に消化管での推進運動を評価するためのアプローチを学ぶことは簡単でシンプルです。

Abstract

消化管運動のモニタは、（GIMM、野猫研究開発、セントオールバンズ、VT）モルモット遠位大腸の孤立セグメントの推進運動を監視するin vitroの系です。完全なシステムは、コンピュータ、ビデオカメラ、照らされた臓器の風呂、ポンプを循環蠕動と温水槽、およびデータを記録して分析するためのカスタムGIMMソフトウェアで構成されています。結腸蠕動運動を監視する従来の方法と比較して、GIMMシステムは、運動の継続的、定量的に評価することができます。モルモット遠位結腸を暖め、酸素クレブス液に包まれ、そして経口最後に挿入された糞は約2mm /秒の速度でコロンのセグメントに沿って推進されています。セグメントに沿って糞の処理を進めるのムービーがキャプチャされ、そしてGIMMソフトは糞の塊の進行状況を追跡に使用することができます。推進運動の速度は、セグメント全体のためや、興味のある特定の地域のための得ることができます。ボーラスによって誘発される運動パターンの分析に加えて、時空間マップは自発運動のパターンを評価するためにキャプチャされたビデオセグメントから構築することができます。このシステムのアプリケーションでは、薬理学的推進運動に対する受容体アゴニストとアンタゴニストの効果の評価、だけでなく、炎症やストレスなどの病態生理学的状態、より結果がその変化の評価が含まれています。 GIMMシステムを使用してモルモット遠位結腸推進運動性アッセイは、学ぶために簡単で単純なもので、その推進運動を評価の信頼性と再現性のある方法を提供する。

Protocol

1。 GIMMのための結腸組織の準備消化管運動のモニター（GIMM）、最初の場所の氷冷したKrebs溶液（121 mMのNaCl、5.9 mMの塩化カリウム、2.5mMのCaCl 2を 、1.2 mMのMgCl 2、25mMのNaHCO 3の内の隔離されたコロンのために遠位結腸のセグメントを準備するには、1.2 mMののNaH 2 PO 4、および8 mMグルコース、95％O 2 / 5％CO 2を通気）。外壁からの残りの腸間膜を除去すると臓器の風呂に入れると、それを区別することができるように口端に小さな切開を行います。注：組織は、最大2時間、アイスクレブス溶液で実験に先立って残ることがあります。 次に、彼らは画像取得との干渉を防ぐためにカメラのフィールドの外にあるので、臓器槽に流入し、流出導管を配置します。継続的に温めておいたと器官浴（37℃）10ml /分の流量で酸素（95％、5％CO 2）クレブスのソリューションを灌流。 セグメントは、中央の1cmのために自由に移動できるように、弛緩の小さな程度をできるように、臓器浴中にどちらかの端に遠位結腸のセグメント（少なくとも5センチ）ピン、経口対肛門の端を追跡する。経口最後は糞の塊を置くことを容易にするために研究者の方に配置する必要があります。セグメントの長さとテンションは縦ストレッチがトランジット（ディクソンらの割合の減少とともに、推進運動の速度に影響を与えるため、結腸のセグメントは、実験の与えられたセット内のすべての実験のための同じ研究者によって同じ方法で確保されるべきである。 、2007）。 準備は、少なくとも30分間平衡させる。 2。 GIMMとデータ収集の設定 GIMMシステムでは、灌流チャンバ内の結腸セグメントは、下から照らされている。コンピュータとのインターフェース、デジタルビデオカメラは、チャンバーの上に配置されている。光照射の光源とGIMMソフトウェアの両方の電源がオンになっていることを確認してください。 GIMMソフトウェアアプリケーションの新しい実験をセットアップした後、蠕動運動を開始するために大腸セグメントの経口最後にエポキシ樹脂コーティングfecalペレットを挿入することにより、第一審を開始。カメラをオンにして録音を開始するために録音ボタンをクリックしてコンピュータ上のカメラのトグルスイッチをクリックしてください。肛門方向のペレットの動きは、ビデオカメラによって記録され、デジタルムービーは後で解析するためにPCに保存されます。ペレットは、結腸セグメントの終わりに達したときに、録音を停止するには、レコードボタンをクリックします。 推進の速度の制御値を取得するには、健康な動物からと薬を適用せずに大腸セグメントで始まります。各実行の間に5分の回復期で、単一の製剤3〜5の試験を実施する。 大腸運動に一定の条件や薬剤の効果を決定するために、各実験条件のための3-5試験/準備を行います。加えて、少なくとも5つの異なる動物から少なくとも5つの異なるコロンでそれぞれ実験を行う。 デジタルムービーの解析では、糞の推進の速度は、それが大腸セグメントのXのCMを通過するペレットにかかる時間として計算されます。 3。時空間マップの構築個々のGIMMの実行から取得したデジタルビデオは、カスタムGIMMのソフトウェアを使用して時空間マップに変換することができます。 横軸に、結腸の直径の変化は、シルエットに、各ビデオフレームにコロンの画像を変換し、グレースケールに全長に沿って直径を計算して変換することによって、時間の経過とともにプロットされます。最終結果は、収縮の領域が白色で表示される間、ペレットとリラクゼーションの領域は、黒表示されることです。 コロンセグメントを介してペレットが移動する距離は、縦軸に表されます。 4。代表的な時空間マップここに示されている様々な実験条件下で結腸のセグメントでペレットの運動性を示す代表的な時空間マップです。 x（水平）軸はペレットがコロンセグメントを介して進行する距離を表し、y（垂直）軸は、時間をかけてペレットの位置を表します。 コントロールのコロン（通常の、未処理）から時空間マップに、ペレットは約2 mm /秒の速度で直線的に進行します。対照的に、大腸内の特定の薬物や炎症の管理は、そのような停止運動性と障害物運動などの混乱運動パターンになる可能性があります。 GIMMからの結果は、y軸は糞便ペレットとx軸は時間を秒単位で表すことによって走行ミリメートルの距離を表している、グラフとして表示することができます。たとえば、DAMGO（D – Ala2、N – ME – Phe4、のGly – ol5）の投与、オピエートμ受容体作動薬は、大腸の推進運動性の低下を引き起こします。

Discussion

消化管の神経を介した推進運動性は、最初のベイリスとスターリング（ベイリスとスターリング、1899）によって一世紀以上も前に記述されていた。この観察結果は、腸神経系（ENS）、自律神経系の異なる部門（ラングレー、1921）などの腸の神経の指定につながった。神経性腸蠕動は、指定されたポイントと反射を介した収縮上記、または経口、反口側の方向に刺激とリラクゼーションのレベルでのストレッチ及び/または粘膜の刺​​激を伴います。その結果、反口側の方向に口頭で内腔の内容を推進させる圧力勾配の世代です。種の多様の小腸では、とラットの大腸で、収縮の蠕動波は、腸のセグメントの内腔に流体の注入によって活性化することができます。モルモット遠位結腸では、天然または人工の糞は、大腸の口端に挿入することができるとコロンのセグメントに沿って、その進捗状況を簡単に監視することができます。このように、モルモット遠位結腸では腸で推進運動性を調査するためのシンプルかつ有用なアッセイを提供する。

蠕動は、神経活性化合物と受容体の数を含む複雑な神経反射である。その結果、EN​​Sの神経伝達に影響を与える化合物は、推進運動の速度に影響を与えます。腸粘膜の腸クロム親和性細胞から主に放出セロトニンは、、蠕動反射の開始に関与している。推進運動性を5 – HT ₄受容体アゴニスト（。。フォックス-オレンスタインら 、1998;グライダーら 、1998）のintralumenal投与により増強されることを示したモルモット遠位結腸、グライダーや同僚を使用して、一方、5のアプリケーションの風呂- HT ₃と5 – HT ₄受容体拮抗薬は、推進力の割合（。。リンデンら、2003b。門脇ら 、1996）に減少。さらに、選択的セロトニン再取り込み阻害薬によるセロトニントランスポーターの阻害薬（SSRI）はまだ、低濃度で蠕動運動を増加させる5 – HT受容体（門脇ら 、1996の脱感作の可能性が高いため、より高い濃度で、蠕動運動が低下します。。。ウェイドら 、 1996年）。モルモット推進運動性に寄与する他のシグナル伝達分子が腸内のニューロン間のシグナル伝達の主要なメディエーターであるニコチン性受容体、体に作用するアセチルコリンが含まれています。より低い濃度が推進の速度（門脇ら 、1996）に影響しないしながらニコチン受容体拮抗薬ヘキサメトニウムとのシナプス伝達をブロックすると、高濃度でペレットの推進力を減少する。長い消化管運動に対する抑制効果を有することが知られているアヘン、およびオピオイド受容体アゴニストは、、（。。; Wood ら 、2009フォックス、オレンスタインら 、1998）モルモット推進運動のモデルでペレットの推進力を減少させる。 、オピオイド拮抗薬のナロキソンを投与した場合に興味深いことに、daikenchuto、嘔吐、腹痛、および無秩序な運動の治療に臨床的に使用される日本の伝統的な漢方薬は、ペレットの推進力の割合が減少し、単独で投与したとき、逆蠕動運動の結果（Wood ら。 2009年）。これらの知見は、大腸運動のパターンで、種々の化合物およびそれらの受容体の寄与を評価するためにモルモット推進運動モデルの有用性を示しています。

、およびこれらの変更は、炎症からの回復（クラウターを後の数週間持続することができる、（ロマックスら、2005。。リンデンら 、2003A）多くの研究は、炎症が大腸の神経細胞の電気的及びシナプス特性の変化につながることが実証されているら、2007;。ロマックスら、2007）。。推進運動で大腸炎誘発性neuroplastic変更の影響はGIMMシステムを使用してモルモット遠位結腸で調べることができます。このシステムは、単に糞ペレットが所定の距離を移動する時間を測定することにより、推進運動を評価する大腸運動を監視する従来の方法、利点がいくつかあります。 、まだGIMMシステムを使用して、より最近の調査がより明らかにして、大腸の炎症誘発性神経可塑性のこれまでの研究では、ペレット推進（。。リンデンら 、2005年リンデンら 、2003A）の速度の低下があることが示されている複雑な変更（ストロングら 、2010）。例えば、ペレット推進の速度は、炎症遠位結腸の潰瘍化した地域で減少され、まだ運動は、隣接する地域、それ以前の"ストップウォッチ"の方法によって認識されない現象に加速される。他の研究では、炎症の活動期の間に運動障害がCOX – 2の阻害に復元できることが示されている（リンデンら 、2004）、まだ超えて存続運動を変化さ炎症の解像度は、COX – 2を区別しない（クラウターら 、2007）である。さらに、これらのその後の研究では、GIMMシステムによって生成された時空間マップは、推進力の減少率に貢献する炎症後の動物で観察された大腸運動の段階的なパターンを明らかにした。

結論では、モルモット遠位結腸推進運動性アッセイはまた、結腸運動に試験化合物および病理学的条件の影響を測定するハイスループットな手段を表し、GIMMシステムは 、in vitro での結腸推進運動を評価するためにシンプルでわかりやすいアプローチを提供します。それは、ペレットの推進だけでなく、自発的な活動パターンを勉強する時空間マップの生成を連続的に測定することができます。従来の方法に比べて、それはまた、定量することができる、デジタルファイルとして再分析し、複数の方法がシステムに保存し、簡単にアクセスすることが、より複雑な現象をもたらすことができる。

Materials

Material Name	Type	Company	Catalogue Number	Comment
Krebs’ Solution
Isoflurane	Anesthesia	Webster Veterinary
Epoxy-coated fecal pellet				native guinea pig pellet dried and epoxy (black nail polish) coated
Forceps		Fine Science Tools
Micro Scissors		Fine Science Tools
Stainless Steel Pins
Beakers				500 mL
Gas Tank				95% O2/5% CO2
Timer
Gastrointestinal Motility Monitor		Catamount Research and Development		http://www.catamountresearch.com/products/gimm.htm