이 프로토콜은 골격 근육에서 격리 mitochondria의 호흡을 연구하는 절차를 설명합니다. 이 방법은 Scorrano에서 적응했다<em> 외.</em> (2007). mitochondrial 절연 절차는 약 2 시간이 필요합니다. mitochondrial 호흡은 약 1 시간에 완료할 수 있습니다.
Abstract
Mitochondria 세포의 삶과 죽음을 제어 organelles 있습니다. 그들은 주요 신진 대사 반응에 참여, ATP의 대부분을 종합하고, 폭포 2,3 신호의 숫자를 조절. 과거 및 현재 연구는 간, 뇌 및 4,5 마음으로 쥐, 생쥐 조직에서 mitochondria 고립있다. 최근에는 많은 연구자들은 골격 근육에서 mitochondrial 기능을 공부에 집중했습니다.
여기서 우리는 골격 근육 6 mitochondria의 격리를 위해 성공적으로 사용한 방법을 설명합니다. 우리의 절차는 모든 버퍼와 시약은 신선했고 골격근의 250-500에 대한 MG 필요한 것을 요구합니다. 우리는 쥐, 마우스 gastrocnemius 및 격막으로부터 격리 mitochondria을 공부하고, 쥐 extraocular 근육. Mitochondrial 단백질 농도는 브래드 포드 분석과 측정됩니다. mitochondrial 샘플 준비 중 및 기능 연구가 비교적 짧은 시간 (~ 1 시간) 이내에 수행되어야 얼음처럼 차가운 유지하는 것이 중요합니다. Mitochondrial 호흡은 37 클라크 타입 전극 (Oxygraph 시스템) ° C 7 polarography를 사용하여 측정됩니다. 산소 전극의 교정이 프로토콜의 핵심 단계이며, 그것은 매일 수행되어야합니다. 절연 mitochondria는 (150 μg) 실험 버퍼 (EB)의 0.5 ML에 추가됩니다. 상태 2 호흡은 글루 탐 산염 (5mM)와 malate (2.5 ㎜)를 추가로 시작합니다. 그런 다음, 아데노신 diphosphate (ADP) (150 μm의)는 주 3 시작에 추가됩니다. Oligomycin (1 μm의), ATPase의 synthase의 차단은 주 4 추정하는 데 사용됩니다. 마지막으로, 카르보닐 청산 가리 P – [trifluoromethoxy]이 – 페닐 – hydrazone (FCCP, 0.2 μm의)가 5 measurestate 추가하거나, 호흡 6 uncoupled입니다. 호흡 조절 비율 (RCR), 주 4 주 3의 비율은 각 실험 후 계산됩니다. RCR ≥ 4 가능한 mitochondria 준비의 증거로 간주됩니다.
요약, 우리는 생화학 (예를 들어, 효소 활동, 면역, proteomics) 및 기능 연구 (mitochondrial 호흡)에서 사용할 수있는 골격 근육에서 가능한 mitochondria의 분리를위한 방법을 제시한다.
Protocol
1. 버퍼의 준비 원심 분리기의 5804R 켜고 4로 설정 ° C. 37 ° C.에 Isotemp 3006D 물 욕조와 세트를 켭니다 근육 분리하기 전에 다음과 같은 솔루션을 준비 : PBS : 증류수 (5 정제 / 리터)의 인산 버퍼 호수 (PBS) 정제를 디졸브. 잘 섞는다. PBS 추가로 10 MM EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) : 100 ML 솔루션을 준비하려면, PBS의 98 ML 500 MM EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 2 ML를 추…
Discussion
우리는 골격 근육에서 가능한 mitochondria를 분리하는 프로토콜을 제시한다. 수율에 문제가있는 경우, 프로토콜은 얼음에 30 분 PBS/10mM EDTA/0.01 %의 트립신 5 ML에서 분리된 근육을 잠복기로 수정할 수 있습니다. 트립신 완벽한 근육 소화를 확인하기 위해서는 근육이 완전히 다진해야합니다. 30 분 부화 후, PBS/10mM EDTA/0.01 %의 트립신 솔루션은 완전히 절연 버퍼 1 (IB1) 3 ML로 교체해야합니다. 또한, 트립신?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품은 FH 안드레 이드하기 위해 국립 안과 연구소 (R01 EY12998)에서 부여에 의해 지원되었다.