Établir embryonnaires de la souris culture de cellules souches neurales utilisant le test Neurosphère
Summary
Ce protocole vidéo démontre l'application du test Neurosphère pour l'isolement et l'expansion des cellules souches neurales de la éminences ganglionnaires du jour embryonnaire 14 cerveau de souris.
Abstract
Dans les mammifères, les cellules souches agit comme une source de cellules indifférenciées de maintenir la genèse des cellules et de renouvellement dans les différents tissus et organes pendant la durée de vie de l'animal. Ils peuvent éventuellement remplacer les cellules qui sont perdues dans le processus de vieillissement ou dans le processus de blessure et de maladie. L'existence de cellules souches neurales (NSC) a d'abord été décrit par Reynolds et Weiss (1992) dans le système nerveux des mammifères adultes central (SNC) en utilisant un système de culture sans sérum roman, l'essai de Neurosphère (NSA). En utilisant ce dosage, il est également possible d'isoler et d'élargir NSCs de différentes régions du SNC embryonnaire. Ces NSCs dans élargi in vitro sont multipotentes et peuvent donner lieu à trois principaux types de cellules du SNC. Alors que la NSA semble relativement simple à réaliser, attention aux procédures démontré ici est nécessaire afin d'obtenir des résultats fiables et cohérents. Cette vidéo montre pratiquement la NSA pour générer et développer NSCs du jour embryonnaire du tissu cérébral de 14 souris et fournit les détails techniques, on peut obtenir pour les cultures Neurosphère reproductibles. La procédure comprend la récolte d'embryons de souris E14, microdissection cerveau pour récolter les éminences ganglionnaires, la dissociation des tissus récoltés dans le milieu de NSC pour gagner une suspension cellulaire unique, et enfin plaquage cellules en culture NSA. Après 5-7 jours de culture, les neurosphères résultant primaires sont passées à élargir le nombre des CNS pour des expériences futures.
Protocol
Discussion
Le test est Neurosphère la méthode de choix pour l'isolement et l'expansion des cellules souches neurales 1-5 raison de sa simplicité et de reproductibilité. Ce test est un outil précieux pour production à grande échelle des cellules précurseurs du SNC indifférencié, qui pourrait être utilisé à la fois in vitro et in vivo. Il convient de souligner que neurosphères pourrait être généré à la fois du bona fide des cellules souches neurales et les progéniteurs plus re…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu financièrement par la Fondation Overstreet.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| NeuroCult NSC Basal Medium | Medium | Stem Cell Technologies | 05700 | |
| NeuroCult NSC Proliferation Supplements | Medium supplement | Stem Cell Technologies | 05701 | |
| %0.05 trypsin-EDTA | Reagent | Gibco | 25300-062 | |
| Soybean trypsin inhibitor | Reagent | Sigma | T6522 | |
| Pen/Strep | Reagent | Gibco | 15140-122 | |
| *MEM | Reagent | Gibco | 41500-018 | HEM component |
| *HEPES | Reagent | Sigma | H4034 | HEM component |
| *Distilled water | Reagent | Gibco | 15230-147 | |
| Cell strainer | Sieve | BD Falcon | 352340 | |
| T25 flask | Culture ware | Nalge Nunc international | 136196 | |
| T80 flask | Culture ware | Nalge Nunc international | 178905 | |
| 15 ml tubes | Culture ware | BD Falcon | 352096 | |
| 50 ml tubes | Culture ware | BD Falcon | 352070 | |
| Fine curved forceps | Surgical tools | Fine Science Tools | 11251‐35 | |
| Small fine forceps | Surgical tools | Fine Science Tools | 11272‐30 | |
| Small forceps | Surgical tools | Fine Science Tools | 11050‐10 | |
| Fine scissors | Surgical tools | World Percision Instruments, Inc. | 500216 | |
| EGF | Growth factor | R&D | 2028-EG | |
| b-FGF | Growth factor | R&D | 3139-FB | |
| Heparin | Growth factor | Sigma | H4784 | Reconstituted in PBS |
*To make HEM, mix 1×10L packet of MEM and160ml of 1M HEPES and bring the volume to 8.75 L using distilled water. Set the final PH to 7.4 and store it at 4°C.
References
- Reynolds, B. A., Weiss, S. Generation of neurons and astrocytes from isolated cells of the adult mammalian central nervous system. Science. 255, 1707-1710 (1992).
- Morshead, C. M. Neural stem cells in the adult mammalian forebrain: a relatively quiescent subpopulation of subependymal cells. Neuron. 13, 1071-1082 (1994).
- Craig, C. G. In vivo growth factor expansion of endogenous subependymal neural precursor cell populations in the adult mouse brain. J Neurosci. 16, 2649-2658 (1996).
- Golmohammadi, M. G. Comparative analysis of the frequency and distribution of stem and progenitor cells in the adult mouse brain. Stem Cells. 26, 979-987 (2008).
- Azari, H., Rahman, M., Sharififar, S., BA, R. e. y. n. o. l. d. s. Isolation and Expansion of the Adult Mouse Neural Stem Cells Using the Neurosphere Assay. J Vis Exp. , (2010).
- Reynolds, B. A., Rietze, R. L. Neural stem cells and neurospheres–re-evaluating the relationship. Nat Methods. 2, 333-336 (2005).
- Louis, S. A. Enumeration of neural stem and progenitor cells in the neural colony-forming cell assay. Stem Cells. 26, 988-996 (2008).
