我们展示了利用DNA芯片为表达对神经系统的分析。我们描述了RNA的质量控制,样品标签,和阵列杂交和扫描。
芯片表达谱的神经系统提供强大的方法,以确定在不同发展阶段,不同的生理或病理状态,对治疗的反应,的基因活动,并在一般情况下,任何正在实验测试条件。神经组织中的表达分析需要的高质量的RNA,分离出的RNA和DNA芯片杂交扩增隔离。在这篇文章中,我们描述了从脑肿瘤组织 2重复的微阵列实验的协议。我们将开始执行一个孤立的RNA样品的质量控制分析与安捷伦2100生物分析仪“实验室的单芯片”技术。高品质的RNA样品的任何芯片实验成功的关键,和2100生物分析仪提供了一种快速,定量测量样品的质量。 RNA样品,然后放大,并通过执行反转录获得cDNA标记,在体外转录标记的核苷酸的存在产生标记的cRNA。我们将通过使用一个双色标记试剂盒,标签我们的实验样品,用Cy3与Cy5的参考样本。两个样本,然后将结合安捷伦的4×44 K阵列杂交。双色阵列提供了两个RNA样品之间的直接比较的优势,从而提高了测量的精度,特别是为表达水平的小变化,因为这两个RNA样品杂交竞争力的一个单一的芯片。阵列将在两个对应的波长进行扫描,并使用Cy3标记,以Cy5的信号为每个功能的比例将作为相应的mRNA的相对丰度的直接测量。这种分析确定,在被测试的实验条件的差异表达基因。
表达与DNA微阵列分析提供了一个简单的方法来确定两个生物样品之间的差异表达基因。成功的表达谱实验需要高品质的RNA样品,强大的标签和杂交。根据我们的经验,安捷伦的商业阵列和标记试剂盒,在合理的成本提供高质量的数据。安捷伦还提供自己的杂交和扫描机器,我们赞成罗氏NimbleGen的GenePix 4000B芯片扫描仪从分子器件的杂交系统。需要注意的是,罗氏NimbleGen的杂交单位前身为MAUI杂交系统。最近由罗氏公司收购后,已经停产的A4混合器。截至写这篇文章的时刻,他们仍然可以通过Kreatech诊断(如其他卖家www.kreatech.com ;这个网站还提供了一个方便阵列的兼容性的工具)被发现,但长期的库存量是不确定的。其他杂交系统(例如,从安捷伦);但是,如果兼容的混频器,可为正在使用的阵列,我们建议罗氏NimbleGen的系统,其质量和可重复性。
The authors have nothing to disclose.
这项工作是支持由教育署补助詹姆斯S麦克唐纳基金会21 世纪的奖励计划,和一个美国国立卫生研究院主任的新的创新奖。 GAB支持部分由加州再生医学研究所的博士后研究。
Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
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2100 Bioanalyzer | Agilent Technologies | G2943CA | Includes chip priming station, vortexer, software and laptop computer | |
2100 Bioanalyzer electrophoresis set | Agilent Technologies | G2947CA | ||
RNA 6000 Nano kit | Agilent Technologies | 5067-1511 | includes size ladder, marker, gel matrix, dye, electrode cleaners, spin filters and nanochips | |
RNase Zap | Applied Biosystems – Ambion | AM9780M | ||
Quick Amp labeling kit, two-color | Agilent Technologies | 5190-0444 | ||
RNeasy mini kit | Qiagen | 74104 | ||
Gene Expression Hybridization Kit | Agilent Technologies | 5188-542 | Includes Blocking agent, Fragmentation buffer and Hybridization buffer | |
Gene Expression Wash Buffer Kit | Agilent Technologies | 5188-5327 | Includes Wash Buffers 1 and 2 and Triton X-102 | |
Hybridization Station | Roche Nimblegen | 05223652001 | 4-slide model | |
Hybridization System Accesory Kit | Roche Nimblegen | 05327695001 | Contains verification assembly for testing mixing, replacement O-rings, disassembly tool, forceps and brayer | |
A4 mixer hybridization chambers | ||||
Whole Human Genome (4×44) Oligo Microarray | Agilent Technologies | G4112F | ||
Positive displacement pipette | Gilson | F148504 | ||
Capillary pistons for positive displacement pipette | Gilson | F148415 | ||
Microarray dryer | Nimblegen | 05223636001 | ||
Microarray fluorescent scanner, Axon GenePix 4000B | Molecular Devices | GENEPIX4000B | ||
GenePix Pro 6.0 software | Molecular Devices |