mStrawberry OP9細胞は共培養からすべてのES由来の子孫の完全な評価が可能になります。
生体内および胚lethalitiesを扱うことなく、造血に関与する最も早い遺伝子を特徴づけるためのアクセスが困難な細胞集団を研究するときに造血細胞の運命に向かってES細胞のin vitroにおける分化と便利です。 OP9ストローマ細胞株が機能的なM – CSFを欠いている大理石骨病変異マウスの頭蓋冠から派生しているとしてES/OP9共培養系は、もともと、マクロファージの過剰産生することなく、造血子孫を生成するように設計されました。 体外 ES/OP9共培養系における初期造血発展を再現するために使用することができます。 OP9ストローマ細胞上で培養した場合、ES細胞は、FLK – 1 + hemangioblasts、造血前駆細胞、そして最終的に成熟し、最終分化の系統に分化する。標準ES/OP9共培養プロトコルは、OP9細胞のコンフルエントな層の上にES細胞の配置を伴う;だけでなく、定期的な再播種の手順を古い除去するためには、OP9細胞を汚染する。さらに、現在のプロトコルは、造血細胞懸濁液中に発見され、分化の毎日で、ES由来の子孫の評価用に最適化されていないを評価伴います。しかし、再播種ステップとだけ浮遊細胞の収穫では、ある者は、潜在的にES由来の子孫と発展途上造血細胞の大部分をミス。この問題は、ノックアウトESラインに関連付けられている造血欠陥を特徴付けるしようとしたときに対処することが重要になります。ここでは、ダウンストリームアッセイからOP9細胞を汚染の除去を可能にする改変ES / mStrawberry OP9共培養を、説明します。このメソッドは、より直接的に胚内で観察された造血分化のパターンに対応する造血分化のパターン、その結果、共培養のすべての日ですべてのES由来の子孫を完全に評価することができます。
共培養の5日目におけるFlk1 +のhemangioblastsの生産でmStrawberry OP9細胞の結果のコンフルエント層上にES細胞の適切な分化。 Hemangioblastsは、図1に観察された細胞の渦巻きを、積み上げた表示されます。共培養の残りの部分では、目に見えるES由来の子孫は、造血細胞のクラスター(図1)として表示されます。 Day6 / 7二から四時に細胞クラスターが表示され、その共培養の8 / 9日間で大規模な細胞クラスター(接着及び懸濁液中の両方)に成長する。他のES由来の子孫にもしっかりと接着間質細胞層内にバインドされていますされています。
プロトコールに記載されていないものの、それは、FBSは、ESの増殖培地、mStrawberry OP9増殖培地およびES / mStrawberry OP9分化のメディアで使用される事前テストに不可欠です。適切にテストされた血清は、分化の5日目までは、共培養におけるES細胞の適切な分化をmStrawberry OP9細胞の適切な成長を確保するだけでなく、してください。代替として、またはmStrawberry OP9細胞に加えて、OP9細胞は、前(7.8×10 4細胞/ cm 2)コンフルエントで播種する、8000ラドで、照射することができる。 OP9細胞の照射は、繰り返し再播種ステップの排除を可能にする、だけでなく、下流のアッセイからOP9細胞を汚染、古いのほぼ完全な排除が可能になります。
OP9細胞は、CMVプロモーターの制御(pRRLsin – CMVベクター、UCLAベクトルコア)の下にレンチウイルスベクターを発現するmStrawberryの3ug/mLとOP9細胞を形質導入することによってmStrawberryタンパク質を発現するように設計されました。
標準ES/OP9共培養のプロトコルは、細胞の継代からOP9細胞を汚染し、古い減らすために、同様に、コンフルエント層OP9細胞上に5日目再播種のステップをES細胞の配置を伴う。さらに、懸濁液中に見られるだけ造血細胞は、ES由来の子孫を評価するために削除されます。しかし、再播種ステップとだけ浮遊細胞の収穫両方では、ある者は、潜在的に開発し、ES由来の造血細胞のかなりの数をミス。この問題は、ノックアウトESラインに関連付けられている造血欠陥を特徴付けるしようとしたときに対処することが重要になります。この問題を回避するために、私たちの研究室はmStrawberry発現OP9細胞を使用して、修正された共培養を使用。これは、すべてのESの子孫は5日目、およびダウンストリームアッセイのためのすべてのES由来の子孫の収穫のために継続的に共培養するために転送されることを保証します。この変更は、ヒトとマウスのESラインの両方に由来する造血子孫の評価および特性評価に便利なツールを提供しています。
様々な段階プリミティブと決定的な造血このES – mStrawberry OP9共培養モデルを反復する。造血開発の初期段階の研究に、多くの人々は、ES細胞から血管芽細胞の発達を評価するBL – CFC(コロニー形成細胞ブラストのような)アッセイを、使用してください。初期造血開発を調査する際BL – CFCアッセイはmStrawberry – ESの共培養システム、便利なツールですが、それは血管芽細胞の評価を可能にするため、同様に、より多くの成人の造血系統を増加ユーティリティを示す。
伝統的なOP9/ESとEBの分化プロトコルを使用して前の仕事は、HoxB4の過剰発現など、多分必要な追加の因子がin vitroでの長期的なデータの再読込み造血幹細胞を導出するためにことを示している。追加作業はmStrawberry負、ソートされたES由来の集団が、真の造血幹細胞が含まれているかどうか評価する必要がある。
The authors have nothing to disclose.
私たちは、設立とmStrawberry OP9細胞株のテストのためにU. Ganapatiに感謝。さらに、我々は、共培養でH. Shafifor彼女の援助に感謝。 HPは、国立心臓、肺、血液研究所(F31HL087714)(HP)からの交わりによってサポートされています。この作品の内容は、執筆者の責任であり、必ずしも国立心臓、肺、血液研究所や国立衛生研究所(NIH)の公式見解を表すものではありません。 UCLAのフローサイトメトリーコアファシリティーは、NIH(CA – 16042およびAI – 28697)、ジョンソンがんセンター、UCLAのエイズ研究所、および医学のUCLAの学校でサポートされています。
OP-9 Cell Maintenance Medium Stock Components
Name of Reagent | Company | Catalog Number | Comments |
aMEM | Invitrogen | 12571-063 | |
FBS | Omega Scientific | FB01 | Pre-Tested |
L-glutamine | Cellgro | 25-005-C I | 200nM |
Trypsin-EDTA | Stem Cell Technologies | 07901 |
ES/OP-9 Cell Differentiation Medium Stock Components
Name of Reagent | Company | Catalog Number | Comments |
aMEM | Invitrogen | 12571-063 | |
FBS | Hyclone | SH30070 | Pre-Tested |
L-glutamine | Cellgro | 25-005-CI | 200mM |
PBS (without Ca2+ and Mg2+) | Cellgro | 21-031-CV | |
Trypsin-EDTA | Stem Cell Technologies | 07901 |